Desenvolvemos um método eficiente e econômico para estabelecer camundongos com manipulação genética especificamente em células-tronco hematopoiéticas, usando tecnologia de edição de genomas e sistemas de entrega de transgene mediados por lentivírus. A vantagem deste protocolo é que podemos criar modelos animais que abrigam mutações específicas em células hematopoiéticas de forma rápida e econômica em comparação com abordagens transgênicas convencionais do rato. Demonstrando o procedimento estará Ying Wang, um pesquisador do meu laboratório.
Para gerar partículas de lentivírus, comece codificando uma placa de seis poços com solução de colágeno e incubando-a a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, sementes células 293T na placa e incuba-la por mais duas horas. Enquanto isso, prepare a mistura de três plasmídeos de transfecção combinando 0,9 microgramas de vetor de lentivírus, 0,6 microgramas de psPAX2 e 0,3 microgramas de pMD2.
G e deionizado para 10 microliters por poço. Em seguida, adicione cuidadosamente 50 microliters de 1X PBS e cinco microliters de PEI MAX diluídos à mistura plasmida, e incubar a mistura à temperatura ambiente por 15 minutos. Após a incubação, adicione um mililitro de DMEM.
Aspire a mídia a partir da placa de seis poços e adicione um mililitro de mistura plasmida a cada poço. Incubar a placa por mais três horas. Substitua a mídia por DMEM fresco e incubar por 24 horas.
Adicione um mililitro de DMEM fresco e incubar mais 24 horas. Após a incubação total de 48 horas, transfira o supernascedor para um tubo de 50 mililitros e centrifuá-lo a 3000 vezes G por 15 minutos para remover quaisquer células flutuantes livres. Filtre o supernatante através de um filtro de 0,45 micrômetro e ultra-centrífuga por três horas.
Aspire cuidadosamente o supernatante, deixando para trás a pelota branca. Suspenda a pelota com 100 microlitadores de meio de expansão de células hematopoiéticas sem soro sem aeração. Mantenha uma alíquota de 10 microliter para medir o título viral e armazene o resto da suspensão a menos 80 Celsius até estar pronto para usar.
Depois de isolar os ossos, coloque-os em um tubo cônico de 50 mililitros com RPMI e coloque o tubo no gelo. Em um armário de biosegurança, transfira os ossos para um prato de cultura estéril de 100 milímetros. Em seguida, segure um osso com fórceps sem cortes, e use uma tesoura de dissecção para cortar cuidadosamente ambas as epífitas.
Encha uma seringa de 10 mililitros com RPMI gelado e use uma agulha de calibre 22 para lavar a medula óssea do eixo em um novo prato de cultura de 100 milímetros. Depois de toda a medula óssea ter sido coletada, faça uma única suspensão celular passando a medula óssea através de uma seringa de 10 mililitros com uma agulha calibre 18. Filtre a suspensão celular através de um coador de células de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros.
Em seguida, centrifugar o tubo de acordo com as instruções do manuscrito e aspirar o supernante. Suspenda as pelotas de célula em um volume apropriado de buffer de separação otimizado. Para isolar as células negativas da linhagem, use um kit de esgotamento de células de linhagem de acordo com as instruções do fabricante.
Suspenda a linhagem isolada de células negativas no meio de expansão de células hematopoiéticas livres de soro. Pré-incubar as células a 37 graus celsius em 5% de dióxido de carbono por duas horas. Em seguida, adicione lentivírus de acordo com as instruções do manuscrito e deixe as células na incubadora por mais 16 a 20 horas.
No dia seguinte, colete as células transduzidas por lentivírus em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifuá-las a 300 vezes G por 10 minutos. De acordo com as diretrizes da NHA, é importante lidar com vetores de lentivírus no Nível Dois do Grupo Reece. Precauções devem ser tomadas, com base nos regulamentos das instalações.
Aspire cuidadosamente o supernascer e suspenda a pelota em 200 microliters de RPMI por mouse. Mantenha as células em temperatura ambiente até o transplante em camundongos. Após a segunda sessão de irradiação, a injeção retro-orbital de células negativas de delineamento em cada camundongo anestesiado usando uma seringa de insulina.
Três a quatro semanas após o transplante de medula óssea, obtenha amostras de sangue da veia retro-orbital usando tubos capilares. Transfira 20 microliters de sangue para tubos de teste de poliestireno de fundo redondo e coloque no gelo. Após a lise RBC, incubar as células com um coquetel de anticorpos monoclonais no escuro por 20 minutos em temperatura ambiente.
Após a incubação, lave, corrija e centrifuge as células e suspenda a pelota celular em 400 microliters de tampão FACS. Mantenha as amostras a quatro graus Celsius até a análise por citometria de fluxo. O sucesso da transdução celular negativa da linhagem pode ser avaliado com detecção citométrica de fluxo de RFP.
Foi demonstrado que após sete dias de cultura in vitro, em média, 75,7% das células são transduzidas. A citometria de fluxo também tem sido usada para analisar o sangue periférico do camundongo após a reconstituição com células-tronco hematopoiéticas transduzidas e não transduzidas. Uma média de 94,8% dos neutrófilos, 93,5% dos monócitos e 82,7% das células B expressam RFP.
O DNA genômico das células sanguíneas RFP positivos foi amplificado e sub-clonado para análise de sequência. Várias mutações são detectadas e 69% dos clones mostram mutações fora do quadro ou de parada prematura. Para ter sucesso com este procedimento, é necessária a preparação de alto estoque antivírus e condições otimizadas para transdução e transplante de células hematopoiéticas.
Aplicamos essa técnica para estudar a lei da doença cardio-vascular. Mas também é útil estudar a malignidade hematológica. Este método nos permite estudar as funções de novos tipos de genes no sistema hematopoiético de alta forma eficiente e alta.
Nós reunimos isso sobre a disponibilidade de ratos transgênicos.
