Wir haben eine effiziente und wirtschaftliche Methode entwickelt, um Mäuse mit Genmanipulation speziell in hämatopoetischen Stammzellen zu etablieren, wobei genome Editing-Technologie und lentivirusvermittelte Transgen-Bereitstellungssysteme verwendet werden. Der Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass wir tierexperimentelle Modelle mit spezifischen Mutationen in hämatopoetischen Zellen im Vergleich zu herkömmlichen transgenen Mausansätzen erstellen können. Demonstriert wird das Verfahren von Ying Wang, einer Forscherin aus meinem Labor.
Um Lentivirus-Partikel zu erzeugen, beginnen Sie mit der Codierung einer sechs Brunnenplatte mit Kollagenlösung und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 30 Minuten. Dann samen 293T Zellen auf die Platte und inkubieren sie für weitere zwei Stunden. In der Zwischenzeit bereiten Sie die Mischung aus drei Transfektionsplasmiden vor, indem Sie 0,9 Mikrogramm Lentivirusvektor, 0,6 Mikrogramm psPAX2 und 0,3 Mikrogramm pMD2 kombinieren.
G und deionisiert auf 10 Mikroliter pro Brunnen. Dann 50 Mikroliter 1X PBS und fünf Mikroliter verdünntes PEI MAX vorsichtig in die Plasmidmischung geben und die Mischung bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren. Fügen Sie nach der Inkubation einen Milliliter DMEM hinzu.
Die Medien aus der sechs Brunnenplatte ansaugen und jedem Brunnen einen Milliliter Plasmidmischung hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte für weitere drei Stunden. Ersetzen Sie das Medium durch frisches DMEM und brüten Sie 24 Stunden.
Fügen Sie einen Milliliter frisches DMEM hinzu und brüten Sie weitere 24 Stunden. Nach einer Gesamtinkubation von 48 Stunden den Überstand in ein 50-Milliliter-Rohr geben und bei 3000-fachem G für 15 Minuten zentrifugieren, um frei schwebende Zellen zu entfernen. Filtern Sie den Überstand durch einen 0,45-Mikrometer-Filter und ultrazentrifugieren Sie ihn drei Stunden lang.
Den Überstand vorsichtig ansaugen und das weiße Pellet zurücklassen. Das Pellet mit 100 Mikroliters serumfreiem hämatopoetischem Zellausdehnungsmedium ohne Belüftung wieder aufhängen. Halten Sie einen 10 Mikroliter Aliquot, um den viralen Titer zu messen und speichern Sie den Rest der Suspension bei minus 80 Grad Celsius, bis sie einsatzbereit ist.
Nach der Isolierung der Knochen, legen Sie sie in eine 50 Milliliter konische Röhre mit RPMI und legen Sie die Röhre auf Eis. In einem Bio-Sicherheitsschrank die Knochen in eine sterile 100-Millimeter-Kulturschale geben. Dann greifen Sie einen Knochen mit stumpfer Zange, und verwenden Sie Sezierschere, um vorsichtig beide Epiphysen zu schneiden.
Füllen Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit eiskaltem RPMI und spülen Sie das Knochenmark mit einer 22-Meter-Nadel aus dem Schaft in eine neue 100-Millimeter-Kulturschale. Nachdem das Knochenmark gesammelt wurde, machen Sie eine Einzelzellsuspension, indem Sie das Knochenmark durch eine 10 Milliliter Spritze mit einer 18-Meter-Nadel passieren. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50 Milliliter konisches Rohr.
Dann zentrifugieren Sie das Rohr nach den Manuskriptrichtungen und aspirieren Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellpellets in einem geeigneten Volumen optimierten Trennpuffers wieder auf. Um negative Linienzellen zu isolieren, verwenden Sie ein Abstammungszell-Erschöpfungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Setzen Sie die isolierten Liniennegativen Zellen in serumfreiem hämatopoetischem Zellausdehnungsmedium wieder auf. Die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für zwei Stunden vorinkubieren. Dann fügen Sie Lentivirus nach den ManuskriptRichtungen und lassen Sie die Zellen im Inkubator für weitere 16 bis 20 Stunden.
Am nächsten Tag sammeln Sie die lentivirus-transduzierten Zellen in einem 15 Milliliter konischen Rohr und zentrifugieren Sie sie bei 300 mal G für 10 Minuten. Gemäß den NHA-Richtlinien ist es wichtig, Lentivirus-Vektoren auf Reece-Gruppe-Ebene zwei zu behandeln. Es müssen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, die auf den Vorschriften der Fazilität basieren.
Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Pellet in 200 Mikroliter N.R.M. pro Maus wieder aufhängen. Halten Sie die Zellen bei Raumtemperatur bis zur Transplantation in Mäuse. Nach der zweiten Bestrahlungssitzung wird jede anästhesierte Maus mit einer Insulinspritze retro-orbital transduziert abgrenzende negative Zellen injiziert.
Drei bis vier Wochen nach der Knochenmarktransplantation erhalten Sie Blutproben aus der retroorbitalen Vene mit Kapillarröhren. 20 Mikroliter Blut in rund-bodenende Polystyrol-Reagenzgläser geben und auf Eis legen. Nach der RBC-Lyse die Zellen mit einem Cocktail monoklonaler Antikörper im Dunkeln 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Nach der Inkubation die Zellen waschen, fixieren und zentrifugieren und das Zellpellet in 400 Mikroliter FACS-Puffer wieder aufhängen. Halten Sie die Proben bei vier Grad Celsius bis zur Analyse durch Durchflusszytometrie. Der Erfolg der Liniennegativzelltransduktion kann mit der zytometrischen Durchflussdetektion von RFP bewertet werden.
Es wurde gezeigt, dass nach sieben Tagen In-vitro-Kultur durchschnittlich 75,7% der Zellen transduziert werden. Die Durchflusszytometrie wurde auch zur Analyse des peripheren Blutes der Maus nach der Rekonstitution mit transduzierten und nicht transducierten hämatopoetischen Stammzellen verwendet. Durchschnittlich 94,8% der Neutrophilen, 93,5% der Monozyten und 82,7% der B-Zellen exprimieren RFP.
Genomische DNA aus den RFP-positiven Blutzellen wurde PCR verstärkt und zur Sequenzanalyse subkloniert. Verschiedene Mutationen werden erkannt und 69% der Klone zeigen a-frame- oder vorzeitige Stop-Mutationen. Um mit diesem Verfahren erfolgreich zu sein, sind die Vorbereitung eines hohen Antivirenbestands und optimierte Bedingungen für die Transduktion und Transplantation hämatopoetischer Zellen erforderlich.
Wir haben diese Technik angewendet, um das Gesetz über Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu studieren. Aber es ist auch nützlich, hämatologische Malignität zu studieren. Diese Methode ermöglicht es uns, die Funktionen neuer Arten von Genen im hämatopoetischen System hocheffizient und hocheffizient zu untersuchen.
Wir sammeln dies über die Verfügbarkeit von transgenen Mäusen.
