لقد طورنا طريقة فعالة واقتصادية لإنشاء الفئران مع التلاعب الجيني على وجه التحديد في الخلايا الجذعية للدم ، وذلك باستخدام تكنولوجيا تحرير الجينوم وأنظمة توصيل transgene بوساطة فيروس العدين. وميزة هذا البروتوكول هو أننا يمكن أن تخلق نماذج حيوانية تحتوي على طفرات محددة في خلايا الدم بطريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة مقارنة مع النهج المعدلة وراثيا الماوس التقليدية. إثبات الإجراء سيكون يينغ وانغ، باحث من مختبري.
لتوليد جزيئات فيروس العدس، ابدأ بتكويد لوحة ستة آبار مع محلول الكولاجين واحتضانها عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. ثم، بذور خلايا 293T على لوحة واحتضانه لمدة ساعتين أخرى. وفي الوقت نفسه، إعداد خليط من ثلاثة بلازميدات عبر الأنف عن طريق الجمع بين 0.9 ميكروغرام من متجه فيروس العدس، 0.6 ميكروغرام من psPAX2 و 0.3 ميكروغرام من pMD2.
G و deionized إلى 10 ميكرولتررس في البئر. ثم، بعناية إضافة 50 ميكرولترات من 1X PBS وخمسة ميكرولترات من MAX PEI المخفف إلى خليط البلازميد، واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة، إضافة ملليلتر واحد من DMEM.
استلهم وسائل الإعلام من لوحة ستة بئر وإضافة ملليلتر واحد من خليط البلازميد إلى كل بئر. احتضان لوحة لمدة ثلاث ساعات أخرى. استبدال وسائل الإعلام مع DMEM الطازجة واحتضان لمدة 24 ساعة.
إضافة ملليلتر واحد من DMEM الطازجة واحتضان 24 ساعة إضافية. بعد الحضانة 48 ساعة، نقل عظمى إلى أنبوب 50 ملليلتر والطرد المركزي في 3000 مرات G لمدة 15 دقيقة لإزالة أي خلايا عائمة حرة. تصفية المُندفع من خلال مُرشح 0.45 ميكرومتر و جهاز طرد مركزي فائق لمدة ثلاث ساعات.
pirate بعناية عظمى، وترك وراءه بيليه بيضاء. إعادة تعليق بيليه مع 100 ميكرولترات من الدم خالية من الدم في الدم خالية من المتوسطة توسيع الخلايا دون تهي. الحفاظ على 10 ميكرولتر aliquot لقياس تتر الفيروسية وتخزين بقية تعليق في ناقص 80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
بعد عزل العظام، ووضعها في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر مع RPMI ووضع الأنبوب على الجليد. في خزانة السلامة الحيوية، نقل العظام إلى طبق ثقافة معقمة 100 ملليمتر. ثم فهم العظام مع ملقط حادة، واستخدام مقص تشريح لقطع بعناية كلا epiphyses.
ملء حقنة 10 ملليلتر مع الجليد البارد RPMI واستخدام إبرة قياس 22 لطرد نخاع العظم من رمح في جديد 100 ملليمتر طبق الثقافة. بعد جمع كل نخاع العظم، قم بعمل تعليق خلية واحدة عن طريق تمرير نخاع العظم من خلال حقنة 10 ملليلتر بإبرة قياس 18. تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70 في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
بعد ذلك جهاز طرد مركزيّ الأنابيب وفقا ل المخطوطة توجيهات ويُشعّر ال خارقة. إعادة تعليق الكريات الخلية في حجم مناسب من العازلة الفصل الأمثل. لعزل الخلايا السالبة النسب، استخدم مجموعة استنفاد خلايا النسب وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
إعادة تعليق الخلايا السلبية النسب المعزول في الدم خالية من الدم خالية من توسيع المتوسطة. قبل احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين. ثم يضاف فيروس العدس وفقا لاتجاهات المخطوطة وترك الخلايا في الحاضنة لمدة 16 إلى 20 ساعة أخرى.
في اليوم التالي، قم بجمع الخلايا التي يسببها فيروس العدس في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر والطرد المركزي منها بمعدل 300 مرة من G لمدة 10 دقائق. وفقا للمبادئ التوجيهية NHA، من المهم للتعامل مع ناقلات فيروس العدين في المستوى الثاني من مجموعة ريس. يجب اتخاذ الاحتياطات، على أساس لوائح المرافق.
الطامح بعناية عظمى وإعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولترات من RPMI لكل فأرة. الحفاظ على الخلايا في درجة حرارة الغرفة حتى زرع في الفئران. بعد الدورة الثانية تشعيع، حقن الرجعية المدارية خلايا سلبية delineage مستحث في كل فأر تخدير باستخدام حقنة الأنسولين.
بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع من زرع نخاع العظم، احصل على عينات دم من الوريد الرجعي المداري باستخدام أنابيب شعرية. نقل 20 ميكرولترات من الدم إلى أنابيب اختبار البوليسترين جولة القاع ومكان على الجليد. بعد تحلل RBC ، احتضان الخلايا مع مزيج من الأجسام المضادة أحادية النسيلة في الظلام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد الاحتضان، وغسل وإصلاح وطاردة مركزية الخلايا وإعادة تعليق بيليه الخلية في 400 ميكرولترات من العازلة FACS. الحفاظ على العينات في أربع درجات مئوية حتى التحليل عن طريق تدفق القياسات. نجاح نسب نقل الخلايا السلبية يمكن تقييمها مع تدفق كشف السيتوميترية من RFP.
وقد ثبت أنه بعد سبعة أيام من الثقافة في المختبر، في المتوسط، يتم نقل 75.7٪ من الخلايا. كما تم استخدام قياس تدفق الخلايا لتحليل الدم المحيطي الماوس بعد إعادة تشكيل مع الخلايا الجذعية الدموية المستحثة وغير المستحثة. في المتوسط 94.8٪ من العدلات، 93.5٪ من أحاديات، و 82.7٪ من الخلايا B التعبير عن RFP.
وقد تم تضخيم الحمض النووي الجينومي من خلايا الدم الإيجابية RFP وتكّني مستنسخة دون مستنسخة لتحليل التسلسل. يتم الكشف عن طفرات مختلفة و 69٪ من المستنسخات تظهر خارج الإطار أو طفرات وقف سابق لأوانه. لتحقيق النجاح مع هذا الإجراء، وإعداد مخزون مكافحة الفيروسات عالية والظروف الأمثل لtransduction وزرع خلايا الدم مطلوبة.
لقد طبقنا هذه التقنية لدراسة قانون في أمراض القلب والأوعية الدموية. ولكن من المفيد أيضا دراسة الأورام الخبيثة الدموية. هذه الطريقة تمكننا من دراسة وظائف أنواع جديدة من الجينات في نظام الدم بكفاءة عالية وعالية.
نحن نجمع هذا على مدى توافر الفئران المعدلة وراثيا.
