Bu protokol, otoimmün hastalıkların tedavisinde istenilen güvenli bir yaklaşım olan fonksiyonel antijene özgü T hücrelerinin çok sayıda oluşturmanızı sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, size çok verimli bir transdüksiyon süreci ve çok sayıda fonksiyonel T hücresi sağlamasıdır. Bu teknik tip 1 diyabet ve antijenlerin bilindiği diğer otoimmün hastalıkların tedavisinde genişletilebilir.
Ayrıca, CAR T hücreleri kanser belirli türleri için umut verici bir tedavi olabilir. Bu yöntem, diğer CAR ifade bağışıklık hücreleri oluşturmak için kullanılabilir. İyi kabul edilen bir teknik olması, tüm protokolü okuması ve tüm denemeyi önceden planlaması önemlidir.
Bu iki haftalık uzun protokol mini adımlar içerir ve başarı her adımın uygun performansbağlıdır. Bu yöntemin görsel gösterimleri, öğrencilerin doğru şekilde izlemeleri için çok önemlidir. Makalede açıklandığı gibi transfeksiyon için Phoenix hücreleri hazırlayın.
Hücrelerin uçmasını en aza indirmek için ortamın eklendiği ve kaldırılacağı yan duvarı işaretlemek iyi bir uygulamadır. Gün sıfır hücrelerden supernatant aspire ve PBS beş mililitre ile yıkayın. Dikkatlice plakayan duvara azaltılmış serum orta damla yedi mililitre ekleyin ve kuvöz geri hücreleri aktarın.
İki 14 milimetre yuvarlak alt polipropilen tüpler için azaltılmış serum orta 1,5 mililitre ekleyin. Tüplerden birine 40 mikrometre transfeksiyon reaktifi ve 15 mikrogram antikor yönlendirilmiş CAR plazmidini ve beş mikrogram ambalaj plazmidini diğerine ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın ve sonra plazmid tüpüne transfeksiyon reaktifi ekleyin.
Çözeltiyi üç kez yukarı ve aşağı boruyla hafifçe karıştırın ve en az 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Phoenix hücrelerine karışımın üç mililitre ekleyin ve bir doku kültürü kuluçka yerleştirin. Dört ila beş saat sonra hücrelere fcs bir mililitre ekleyin ve kültür onları bir gecede 37 santigrat derece.
Ertesi gün, hücrelerden supernatant çıkarın ve taze önceden ısıtılmış kültür ortamı dört mililitre ekleyin. Phoenix hücrelerinden orta içeren virüs toplayarak ve artık hücre enkaz kaldırmak için filtreleme tarafından ikinci gün virüs Hasat. Mililitre başına 200 uluslararası birim son konsantrasyon için virüse rekombinant insan IL-2 stok ekleyin ve transdüksiyon için hemen kullanabilirsiniz.
Phoenix hücrelerine dört mililitre taze ortam ekleyin ve bir gecede kuvöze yerleştirin. İkinci bir transdüksiyon için ertesi gün virüs toplama tekrarlayın ve hücreleri atın. Bir gün önce murine CD8 T hücreleri tohumlama, bir anti-fare CD3 ve CD28 antikorların karışımı bir mililitre ekleyin 24 iyi plaka her iyi ve dört derece Santigrat gecede plaka kuluçka.
Gün sıfır, hasat fare dalak ve buz üzerinde bir hücre kültürü çanak PBS 10 mililitre sırılsıklam bir hücre süzgeci üzerine koyun. Bir hücre kültürü başlık olarak, üç ila beş parçaya her dalak kesilmiş ve tel örgü ile doku basın için bir şırınga steril bir piston kullanın. Splenositleri 1-4 seyreltilmiş kırmızı hücre lisis tamponunda yeniden sulandırarak ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatarak kırmızı kan hücrelerini nazikçe çıkarın ve hücre sayımı için Trypan Blue ile hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini seyreltin.
Ve yedi dakika boyunca 350 kez g santrifüj ederek hücrelerin geri kalanı pelet. CD8 T hücrelerini zenginleştirmek ve hücre peletlerini 400 mikrolitre tamponda, 100 mikrolitre biotin antikor kokteyli ile bir kere10'dan sekizinci hücrelere kadar askıya almak için bir fare CD8 T hücre izolasyon kiti kullanın. Hücre süspansiyonuna iyice karıştırın ve antikor bağlanmasıiçin dört santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra etiketleme tampon 300 mikrolitre ve 8 hücreleri için bir kez 10 başına Anti-Biotin MicroBeads 200 mikrolitre ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın ve 4 santigrat derecede 10 dakika daha kuluçkaya yatırın. Bu arada, ayırıcı üzerinde bir ayırma sütunu ayarlayın ve etiketleme arabellek üç mililitre ile yıkayın.
Bir sütunun üstüne 40 mikrometrelik bir hücre süzgeci koyun ve bir mililitre boncuk ve hücre karışımını süzgeçten ayırma sütununa geçirin. Önceden itil 15 mililitrelik bir tüp içine akışı toplamak ve aynı tüp içine atık toplama, üreticinin talimatlarına göre sütun yıkayın. Hücreleri sayın ve beş dakika boyunca 350 kez g santrifüj ile toplayın.
Tekrar t hücreli orta ve santrifüj iki mililitre ile yıkayın. Daha sonra mililitre başına 250, 000 ila 500, 000 hücre konsantrasyonu ile önceden ısıtılmış T hücre orta onları yeniden askıya. Önceden hazırlanmış CD3 ve CD28 antikor kaplı plakaları bir mililitre steril PBS ile üç kez yıkayın ve her kuyuya iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Hücreleri eşit olarak dağıtmak için dönen bir hareket kullanın. Bir kontrol olarak, plaka tek bir kaplamasız kuyu içine CD8 T hücreleri aynı sayıda plaka plaka ve 48 saat boyunca% 10 karbondioksit gaz tankı kuluçka 37 derece santigrat hücreleri kuluçka. İlk gün, 24 kuyulu bir plakanın kuyularına 0,5 mililitre fibronektin ekleyerek ve gece boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatarak insan fibronektin parçalı kaplamalı plakalar hazırlayın.
Ertesi gün, fibronektin çözeltisi kaldırmak ve iyi başına% 2 BSA ve PBS bir mililitre ekleyin. Tabağı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın ve tedavi edilen kuyuları bir mililitre steril PBS ile yıkayın. Plaka yıkama çözeltisi çıkardıktan sonra kullanıma hazırdır.
Trypan Blue kullanarak etkinleştirilen CD8 T hücrelerini sayın. Santrifüj ile toplayın. Ve onları mililitre başına 5 milyon canlı hücrede yeniden uzaklaştırArak transdüksiyon için.
Fibronectin kaplı plakanın her kuyuya aktif CD8 hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini ekleyin. Daha sonra orta içeren daha önce hazırlanmış virüs 1,5 ila iki mililitre ekleyin ve eşit hücreleri dağıtmak için dönen bir hareket kullanarak karıştırın. Plakayı Ziploc çantasına kapatın ve 37 santigrat derecede 90 dakika boyunca 2,000 kez g'de santrifüj edin.
Plakayı santrifüjden çıkarın ve biyolojik bir güvenlik kabinine götürün. Plastik poşeti dikkatlice çıkarın ve plakanın dışının orta ile kirlenmediğinden emin olun. Plakayı 37 santigrat derece karbondioksit kuvöze aktarın.
Dört saat sonra, her kuyudan bir mililitre orta yıkın, önceden ısıtılmış tam T hücreli ortamın bir mililitresini değiştirin ve plakayı kuvöze geri koyun. Bu protokolün kritik yönleri yüksek bir titre virüs, sağlıklı aktif T hücreleri ve uygun transdüksiyon yöntemidir. Hücreler, akım sitometrik analizi için PE boyutu yedi konjuge anti-CD8, AF647 konjuge anti-CD3 ve BV 421 konjuge anti-CD28 ile birlikte boyandı.
Yaklaşık olarak, CD8 T hücrelerinin yaklaşık %70'i CAR ekspresyonunu gösteren GFP'yi birlikte ifade eder. Ayrıca CD28 ve CD3'ün ortak ifadesini de verdiler. Daha da önemlisi, test GFP pozitif hücrelerin tüm i-Ag7 insülin BR3 tetramerleri ile eş-lekeli hücre yüzeyinde CAR ifade gösterir ama kontrol tetramer ile değil.
Ayrıca, sıralanmış test ve kontrol CAR T hücreleri her transduced hücrelerin bir CD8 efektörü T hücre fenotip ana antikorların hedefe yönelik olduğunu doğrulayan onların cognate ligands ifade hedef hücreleri ile coculture sonra interferon gama yüksek düzeyde salgılanan. Virüs üretici hücrelerinin transdüksiyonu, birincil CD8 T hücrelerinin izole edilmesi ve bu T hücrelerinin aktivasyonu bu deneyin en önemli adımlarıdır. Sağlıklı aktive T hücrelerinin olması ve uygun reaktifler ile bu T hücrelerinin transdüksiyon olumlu sonuçlar sağlar.
Bu yöntem diğer T hücrelerini nakletmek için kullanılabilir, ancak belirli T hücre türü için özelleştirilmelidir. Bu protokol antijene özgü şimerik antijen reseptör T hücre tedavisi ile tip 1 diyabetin önlenmesi için önünü açar.
