Ortaya çıkan kanıtlar sinir yaralanması bağlamında nöropatik ağrı gelişimi ve aksonal onarım dorsal kök ganglion makrofajlar katkısı ima etmiştir. Dorsal kök ganglion makrofajlarının yanıtı hızla fenotipleme bilinmeyen nöroimmün faktörleri belirlemek için istenir. Burada laboratuvarımızın enzimsiz mekanik ayrışma protokolü kullanarak dorsal kök ganglinden makrofajları nasıl hızlı ve etkili bir şekilde izole ettiğimizi gösteriyoruz.
Bu protokol standart enzimatik protokollere kıyasla çok daha az zaman alır ve biz bunu floresan tarafından aktive edilmiş hücre sıralama analizlerimiz için rutin olarak kullandık. Deneye başlamadan önce, dokuz ciltlik orta yı kalsiyum ve magnezyumsuz 10X HBSS ile karıştırarak yoğunluk gradyan ortamının çalışma çözümlerini hazırlayın ve buzda tutun. Farenin arka pençe kıskacına yanıt verilmemesi nedeniyle tamamen anestezi yediğini doğrulayın.
Bant ile sabitlenmiş dört pençeleri ile supine pozisyonda bir kimyasal duman kaput içinde bir anestezili fare yerleştirerek başlayın. Göğüs kafesinin altındaki deriyi kaldırmak için forseps kullanın. Ve sonra cerrahi makas ile, karaciğer ve diyafram ortaya çıkarmak için küçük bir kesi yapmak.
Aynı makas kullanarak, diyafram ve göğüs kafesi kesti. Ve sonra atan kalbi ortaya çıkarmak için plevral boşluğu açın. Iris makas ile sonraki, hızlı bir şekilde sağ atriyal eki kesti.
Kanama fark edildikten sonra, sol ventrikülün arka ucuna 30 kalibrelik bir iğne yerleştirin ve hayvana nüfuz etmek için yavaş yavaş 10 mililitre önceden soğutulmuş 1X PBS enjekte edin. Dorsal laminektomi yapmak için fareyi yatkın konuma getirin. Torasik bölgeden sakral bölgeye kadar iki boylamsal lateral derin kesi yapmak için bir boyut 11 neşter kullanın.
Sonra dorsal kas tabakası açığa deri kaldırın. Daha sonra Friedman-Pearson rongeur ile, lumbosacral omurga süreçleri ve bilateral enine süreçler maruz kalana kadar bağ dokuları ve kasları soyma. İlk olarak, dikkatle dorsal spinal kolonu açmak için bir Friedman-Pearson rongeur kullanın, sonra vertebra kemikleri kaldırmak için bir Friedman-Pearson rongeur ve Noyes bahar makası arasında geçiş, sağlam spinal sinirler bağlı omurilik açığa.
Dikkatle ipsilateral ve kontrlateral lomber DRG diseksiyon. Bir milimetrelik buz gibi kalsiyum ve magnezyumsuz 1X HBSS'ye yerleştirin. 20 ila 25 kez gevşek bir pestle ile Dounce homogenizer DRG doku homojenize.
Steril bir steril 70 mikrometre naylon hücreli süzgeç steril bir 50 mililitrekonik tüp yerleştirin. Hücre süzgecini ıslamak için 800 mikrolitre buz kodu 1X HBSS kullanın. Homojenize doku süspansiyonu ile Homojenleştiriciden ıslak hücresüze almak ve 50 mililitrelik konik tüpe toplamak için bir pipet kullanın.
Homogenizer'i 800 mikrolitre buz soğuğu 1X HBSS ile iki kez durulayın ve sıvıyı aynı 50 mililitrelik konik tüpe toplayarak verimi artırın. Steril beş mililitre polistiren şişe tüpü içine dengelenmiş buz soğuk izotonik yoğunluk gradyan orta 1,5 mililitre ekleyin. Hücrehomojen50 mililitrelik konik tüpten bu şişe tüpüne aktarın.
Ve pipet yukarı ve aşağı iyi karıştırmak için. Üst mühür için 1X HBSS ek 500 mikrolitre ekleyin. Hücreleri 800 kez G'de 20 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.
Tüpün altındaki hücre peletini rahatsız etmeden orta ortamda miyelin içeren süpernatantı dikkatlice aspire edin. Pelete %5 fetal sığır serumu içeren 100 mikrolitre PBS ekleyin ve DRG hücrelerini yeniden askıya alın. Sonra hücrelere alfa fare CX3CR1 APC antikor ekleyin ve bir saat boyunca dört derece santigrat karanlıkta kuluçka.
Hücreleri bir kez beş mililitre PBS ile yıkayın. Hücreleri 360 kez G'de dört santigrat derecede sekiz dakika santrifüj edin. Supernatant aspirate ve sonra tekrar hücre pelet askıya 300 mikrolitre PBS gerçekler analizi için.
Makrofajları tüketmek için MaFIA farelere FK-bağlayıcı protein dimerizer AP intraperitoneal enjeksiyonları sonra, kontrollü araç tedavi fareler ile karşılaştırıldığında AP tedavi farelerin DRGs GFP pozitif hücrelerin önemli bir kaybı vardı. Gerçekler analizi AP tedavi farelerde GFP yüksek nüfus başarılı bir tükenmesi ortaya ve izole hücrelerin yüksek kalitesini gösterdi. Araç tedavi edilen hayvanların DRG'sinden toplam izole hücrelerin %4'ü GFP yüksek makrofajlardı.
Buna karşılık toplam DRG hücrelerinin sadece %0.4'ü AP-treated farede GFP yüksek makrofajlardı. Yabani farelerden mekanik olarak izole edilmiş DRG hücreleri alfa fare CX3CR1-APC antikorile boyandı. DRG hücrelerinin %6'sı CX3CR1 pozitif makrofajlardı.
Hücre canlılığı propidium iyodür ile değerlendirildiğinde, taze izole DRG hücrelerinin %80'inden fazlasının canlı olduğunu ortaya koymuştur. Yetersiz hücre verimi belirtilmişse, DRG dokusunun yetersiz veya aşırı homojenizasyonundan şüphelenilebilir. Buna ek olarak, DRG diseksiyon yeni başlayanlar için tekrarlanan uygulama gerektirebilir.
Muhtemelen protokolümüzün uygulaması uydu hücreleri ve T hücreleri gibi diğer nöronal olmayan hücreleri incelemek için genişletilebilir. Hücre izolasyonunun etkinliğini doğrulamak için daha ileri çalışmalar gerekebilir.
