Bu çalışma NIH (R01NS064288) ve Craig H. Neilsen Vakfı FZ hibe ile desteklenmiştir.

1. Lameller, Kültür, Orta ve Sindirim Enzimler hazırlanması <ol><li> 12-mm yuvarlak # 1 bardak lamelleri nöron kültürü için kullanılır. % 10 HCL gecede 3 kez (20 dakika / saat) distile ve deiyonize su ile ultrasonik yıkama takip ile lamelleri temizlenir. Temizlenmiş lamelleri gelecekteki kullanım için% 70&#39;lik etanol içinde depolanır. Her bir deney başlamadan önce, lamelleri hava kültürü plakası içine kurutuldu ve yerleştirilir. </li><li> Kaplanmasına katkıda kurutulmuş lamelleri, 100 ug / ml Poly-D-Lizin ve 10 ug / ml Laminin çalışma çözeltisi içeren kaplama solüsyonu 100 ul her bir coverslip üzerine eklenir ve kültürü plakası, bir 37 ° C inkübatöründe aktarılır. 1-2 saat sonra, kaplama solüsyonu kaldırılır ve lamelleri steril 1X PBS ile 3 defa yıkanır. </li><li> Kültür ortamı, Asgari Temel Orta (MEM) hazırlamak için% 5 fetal sığır serumu (FBS), 1X Penisilin-Streptomisin solüsyonu (penisilin 500 adet ile güçleniyorLin ve streptomisin 500 mg), 1X GlutaMAX-I takviyesi ve antimitotic reaktifleri ihtiva eden 20 uM 5-floro-2-deoksipsödoüridin ve 20 uM üridin (FDU / R). Serum içermeyen aracı için, FBS takviyesi B27 ile değiştirilir. </li><li> Kollajenaz bir çözeltisi, 1 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyonda çalışma yapmak kollajenaz MEM ile bir toz çözülmesiyle hazırlanmıştır. Tripsin için, 1X TrypLE Hızlı kullanılır. </li></ol> 2. Yetişkin Fare DRG Nöronlar diseksiyonu ve Hasat <ol><li> 6 euthanizing sonra - 10 hafta eski yetişkin fare, dorsal deri kaldırmak ve tüm belkemiğine kesti. 1 X PBS 2-3 kez kaldırıldı omurga yıkayın. </li><li> Ventral yüzü yukarı ile diseksiyon plakasına kaldırıldı omurga Pin ve dikkatli bir diseksiyon mikroskobu altında duyu sinirleri açığa kasları kaldırır. Kereste seviyesinde DRG&#39;ler bağlı sinirler bulmak için kalın ve kolaydır. Bu nedenle, çoğu deneyler için lomber sadeceDRG&#39;ler hasat edilir. </li><li> Küçük bir makas ile merkez boyunca her omur boyunca kesin ve dikkatle intervertebral diskleri kaldırın. Omurilik maruz Her omur bölmek forseps kullanma. </li><li> Kereste DRG&#39;ler dışarı incelemek için, forseps ile her kereste sinir yukarı kaldırın ve ilgili DRG&#39;ler lomber (L1 L6 için) bulmak için omuriliğe doğru iz. </li><li> Bağlı periferik sinir, yay makas ile dorsal ve ventral kökleri her DRG kesti ve buz üzerine yerleştirilir MEM orta mikrofuge&#39;de tüp içinde saklayın. Farklı spinal düzeyleri (örneğin göğüs DRG) daha DRG&#39;ler benzer bir şekilde, gerektiğinde dışarı disseke edilebilir. </li></ol> 3. Sindirim ve Erişkin Fare DRG Nöronlar arasında Ayrılma <ol><li> Tüm parçalara DRG&#39;ler toplanmasından sonra, 1 ml kollajenaz bir çözeltisi ile MEM ortam değiştirmek ve 90 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edilir mikrofuj tüpü. </li><li> Böylece 500 ul 1X TrypLE Express ile kollajenaz bir çözüm değiştirin37 Direkt Ekspres ve inkübe ° C&#39;de 15-20 dk. </li><li> TrypLE Express çözümü çıkarın ve 3 kez 1 ml hazırlanmış besiyeri (% 5 FBS içeren) ile DRG&#39;ler yıkayın. </li><li> 600 ul kültür ortamı ekleyin ve hafifçe 1 ml mavi kullanarak 20-30 kez dokulara öğütmek için yukarı veya aşağı pipetleme ve pipet mezun oldu. </li><li> Triturasyonun sonra, non-disosiye dokuların mikrofuge&#39;de altına yerleşir ve 10 ml steril tüpe hücre süspansiyonu aktarılmasına olanak tanıyor. Başka bir 600 ul kültür ortamı ekleyin ve en dokular ayrışmış kadar triturasyonun adımı tekrarlayın. Elde edilen hücre süspansiyonu nöronları ve non-nöronal hücrelerde hem de içerir. Çoğu durumda, 6 DRG&#39;ler (~ 5 x10 4) gelen hücreleri bir elektroporasyon reaksiyon için kullanılır. </li></ol> 4. Elektroporasyon ile Nöronlar Genetik Manipülasyon <ol><li> DNA plazmidleri (~ 10 ug ile birlikte fare nöronlar için Amaxa nucleofection solüsyonu karıştırılarak transfeksiyon çözeltisi hazırlayın) Veya siRNA oligos (~ 0.2 nmol), her transfeksiyon için 100 ul son hacim yapmak. </li><li> Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 680 rpm&#39;de santrifüje ayrışmış hücreleri ve mümkün olduğunca süpernatan atılır. Hazırlanan transfeksiyon çözüm ekleyin ve yavaşça yeniden askıya hücrelere 200 ul pipet uçları ile 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme ve. </li><li> Elektroporasyon küvetine transfeksiyon çözeltisi ile karıştırılır hücre süspansiyonu transferi ve Amaxa Nucleofector sistemi program G-013 kullanılarak hücrelerin electroporate. </li><li> Elektroporasyon hemen sonra, önceden ısıtılmış 500 ul ekleyin (37 ° C) küvet ve istenilen hücre yoğunluklarında kaplı kültür plaka içine tüm çözüm (~ 600 ul) aktarmak için FBS içeren kültür ortamı. Yeniden süspansiyon ve yeniden kaplanması gerektirir deney için, nöronlar, yüksek yoğunluklu (10.000-20.000 hücre / çukur) azından plastik çanak kültürü üzerinde doğrudan kültürlenmiştir. Doğrudan akson büyüme inceliyor deney için, nöronlar kaplama ont vardırdüşük yoğunluklu (3000-5000 hücre / kuyu) az kaplı cam lamelleri o. Kuluçka (37 ° C&#39;de,% 5 CO2) içine kültürü plakası yerleştirin. </li><li> Nöronlar yüzeye bağlı olan zaman kaplama sonra dört saat, yavaşça 500 ul taze ve önceden ısıtılmış kültür ortamı ile kültür ortamı (Amaxa nucleofection çözüm içerir) yerine ve (37 ° C ilave kültürü için inkübatöre plaka dönmek ,% 5) 2 CO. FBS içeren hem kültür ortamı veya serum içermeyen aracı madde, bu aşamada kullanılır. </li></ol> 5.. Axon Büyüme Analizi için Kültürleme Yetişkin DRG Nöronlar <ol><li> DNA plazmid ile transfekte nöronlar için, gen-of-ilgi ifadesi (örneğin EGFP) elektroporasyon sonra bir kaç saat gibi erken görülebilir. SiRNA&#39;lar ile transfekte nöronlar için, genellikle endojen proteinlerin yeterli tükenmesine izin vermek için 3-4 gün bekleyin. Kültüre nöronlar ya doğrudan vario az akson büyüme analizi için sabit olabilirbize zaman noktaları (1-4 gün elektroporasyon sonra) veya yeniden kapanmıştır ve akson büyütme (bkz. aşağıda) analiz etmek için yeniden kaplanmıştır. </li><li> RNAi aracılı-kaybı fonksiyon çalışmaları için, kültürlü nöronlar yeniden askıya alınabilir ve aksonları hedef proteinleri zaten tükenmiş olan nöronlar, gelen regrow izin vermek için yeniden kaplanmıştır. Bunu yapmak için, kültür plakasından ekli nöronlar yeniden askıya 6-10 kez 1 ml önceden ısıtılmış taze orta ve pipet yavaşça yukarı ve aşağı ile yüksek yoğunluklu kültürlü nöron eski kültür ortamı değiştirin. Nöronal olmayan hücrelerde (örneğin Schwann hücreleri) nöronlar daha kültürü çanak çok daha sıkı bağlamak için, yeniden askıda hücreler çoğunlukla nöron vardır. </li><li> Bir mikrofuge&#39;de tüpüne yeniden askıda nöronlar aktarın ve yavaşça tek hücre süspansiyonu haline hücre kümelerinin yeniden ayırmak için 10-15 kez çiğnemek. </li><li> Düşük yoğunluklu (3000-5000 hücre / kuyu) ve kültür gece boyunca yeni hazırlanmış lamelleri üzerine Re-plaka yeniden disosiye nöronlar (16-24 saat). </li></ol> 6. Fiksasyon, Immuno-boyama ve Floresans Görüntüleme <ol><li> Ortamı aspire ve oda sıcaklığında 15-20 dakika için hücreler sabitlemek için% 4 paraformaldehid (PFA) (de 200 ul /) ilave edilir. Sabit hücreleri daha sonra 3 defa PBS ile yıkandı, 1X edilir. </li><li> PBS aspire ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca sabit bir nöronlara engelleme çözeltisi (% 1 sığır serum albümin,% 0.1 Triton X-100 ve 1X PBS içinde% 2.0 normal keçi serumu) ilave edilir. </li><li> Etiket aksonlardan için, nöronlar anti-nörofilament veya anti-βIII tübülin antikoru ile immüno-lekeli vardır. Bunu yapmak için, her coverslip için bir parafilm birincil antikor çözeltisi (-βIII tubulin antikoru için 1:1200 dilüsyon) bir 30μl damla yerleştirin. Lamelleri tersine ve oda sıcaklığında 60 dakika için primer antikor çözeltisi üzerine yerleştirmek. </li><li> Özgün kültür plakasına lamelleri dönün ve 3 kez 1X PBS ile yıkayın. </li><li> Ikincil bir için aynı işlemi tekrarlayıntibody. </li><li> 3 kez distile su ile lamelleri yıkayın, sonra montaj çözümü (örneğin Altın Antifade Prolong) ile cam lamlara lamelleri monte edin. </li><li> Lekeli nöronlar bir dijital kamera ile donatılmış herhangi bir floresan mikroskobu sistemi ile görüntülenebilir. Akson uzunlukları ölçülür ve görüntü analiz yazılımı ile analiz edilmiştir. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Herhangi bir katma ekstrasellüler büyüme faktörlerinin yokluğunda, yetişkin DRG nöronların genellikle ilk Kaplama sonrası akson 48 saat büyümeye başlar. Aksonlar sık dallı morfolojilere (Şekil 1) göstermektedir. Buna karşılık, yeniden kaplama nöronlar Kaplama sonrası akson sadece bir kaç saat uzatmak başlatın ve aksonlar çok azaldı dallanma (Şekil 2) ile uzatıyoruz. Bu sonuçlar, yeniden kaplama nöronlar conditioning lezyonlanan nöronların benzer özellikleri paylaşan olduğunu düşündürmektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, son zamanlarda gerçekleştirdik kaybı-fonksiyon-vitro çalışmalarda erişkin DRG nöronlardan gelen akson büyüme akson rejenerasyonu ilişkili transkripsiyon faktörü c-Jun rolünü incelemek için. Sonuçlar, c-Jun farklı bölgelerinde (ON-TARGETplus) hedefleme 4 siRNA&#39;lar farklı bir grup olduğu elektroporasyon belirgin şekilde (Şekil 3) 3 gün sonra, transfeksiyon yetişkin DRG nöronlarında 9 c-Jun ve protein seviyeleri azaltılmış gösterdi. 9:;: c-Jun Knockdown nöronlardan gelen nöronlar yeniden kaplama ve kültürlü idi gecede, akson büyüme önemli ölçüde (262,32 ± 15.69 mikron, Şekil 3 si-c-Jun 348,37 ± 16.21mm Kontrolü) azalmıştır. Bu sonuçlar kültürlü yetişkin DRG nöronların yetişkin nöronlardan gelen akson büyüme çalışmak için yararlı bir model sistem sağlamak göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig1.jpg" /> Şekil 1. Yetişkin fare DRG nöronlar 3 gün için düşük yoğunluklu kültüre. Nöronlar anti boyandı - &amp; beta; III tubulin antikor. En aksonlar dallı morfolojileri göstermek unutmayın. Ölçek çubuğu: 125 mikron. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig2.jpg" /> Şekil 2. Kültür 3 gün sonra nöronlar DRG Yeniden kaplama yetişkin fare. (A) Yetişkin DRG nöronlar 3 gün boyunca yüksek yoğunlukta kültüre. (B) Yeniden kaplama yetişkin DRG nöronlar gece boyunca düşük yoğunluklu kültüre edildi. Çoğu akson biraz akson dallanma ile uzamış morfolojileri göstermektedir unutmayın. Ölçek çubuğu: B. A ve 125 mikron 250 mikron <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig3.jpg" /> Şekil 3. In vitro yetişkin DRG nöronlardan gelen akson büyüme c-Jun Rolü. C-Jun siRNA&#39;lar bir elektroporasyon sonra nöronlar DRG yetişkin fare c-Jun (A) Western Blot analizi. Sonuç c-Jun belirgin olarak azalır seviyesini gösterir. (B) EGFP ile transfekte Kontrol nöronlar yeniden kaplama ve gece kültürden sonra uzun aksonlar büyüdü. (C) Co-transc-Jun siRNA&#39;lar ve yeniden kaplama ve geceleme kültürden sonra yetişkin DRG nöronlardan EGFP bozulmuş akson büyüme memnuniyetsizliktir. Kırmızı: Tuj-1 boyanmasının; Yeşil: EGFP. Ölçek çubuğu: 125 mikron. Bu sonuçlar, Saijilafu ark yayınlanmıştır. 9.

<ol>
	<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration.">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).</li><li>Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Intrinsic+Mechanisms+of+Axon+Regeneration.">Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. , (2010).</li><li>Zhou, F. Q., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+control+of+developmental+and+regenerative+axon+growth.">Intracellular control of developmental and regenerative axon growth.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).</li><li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury.">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23, 83-91 (1999).</li><li>Liu, R. Y., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+signaling+pathways+mediate+regenerative+versus+developmental+sensory+axon+growth.">Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth.</a> J. Neurosci. 21, RC164 (2001).</li><li>Zhou, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+support+regenerative+axon+assembly+over+CSPGs+by+an+ECM-integrin-independent+mechanism.">Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism.</a> J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).</li><li>Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axotomy-induced+Smad1+activation+promotes+axonal+growth+in+adult+sensory+neurons.">Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).</li><li>Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF-induced+axon+growth+is+mediated+by+localized+inactivation+of+GSK-3beta+and+functions+of+the+microtubule+plus+end+binding+protein+APC.">NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC.</a> Neuron. 42, 897-912 (2004).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons.">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).</li><li>Costigan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicate+high-density+rat+genome+oligonucleotide+microarrays+reveal+hundreds+of+regulated+genes+in+the+dorsal+root+ganglion+after+peripheral+nerve+injury.">Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury.</a> BMC Neurosci. 3, 16 (2002).</li><li>Xiao, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+expression+profile+of+dorsal+root+ganglion+in+the+rat+peripheral+axotomy+model+of+neuropathic+pain.">Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).</li><li>Michaelevski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+to+transcription+networks+in+the+neuronal+retrograde+injury+response.">Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response.</a> Sci. Signal. 3, ra53 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Yetişkin DRG nöronlar böylece yetişkin hayvanlarda akson rejenerasyonu incelemek için yararlı bir sistem sağlayarak, sağlam in vivo ve in vitro periferik sinir hasarı sonrası kendi aksonlar rejenere. Yetişkin DRG nöronların in vitro kültüründe moleküler mekanizmaları araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline geliyor hangi akson rejenerasyonu düzenlenir. Kültür yetişkin fare DRG nöronların in vitro prosedürü burada rejeneratif akson büyüme hızlı ve etkin bir genetik çalışma sağlar sundu. Bu aksonlardan hedef proteinin zaten tükendikten hangi nöronların den yeniden büyümesini sağlar, çünkü tekrar tekrar süspansiyon ve kaplama işlemi-kaybı fonksiyon çalışmaları için özellikle yararlıdır. Ayrıca, yeniden kaplama kültürlü DRG nöron böylece in vitro akson rejenerasyonu çalışmak için daha fizyolojik alakalı bir yaklaşım sağlayarak, in vivo klima lezyon etkisi bir taklit eder. Yetişkin DRG n transfeksiyon verimtarif elektroporasyon yaklaşımı ile eurons akson büyüme morfolojik analizi için yeterli yapıları, boyutlarına bağlı olarak DNA plazmidlerin yaklaşık% 20-50 olduğunu. Elektroporasyon ile karşılaştırıldığında, viral-aracılı gen aktarımı DRG nöronlar kullanılarak biyokimyasal analizi için uygun olan çok daha yüksek verim, sahiptir. Ancak, inşa ve her gen-of-ilgi için virüs üreten çok daha emek yoğun ve zaman alıcıdır. SiRNA oligos için transfeksiyon verimliliği mümkün olan yetişkin DRG nöronların biyokimyasal analizler yapar hedeflenen proteinleri (Şekil 3A bakınız), aşağı vurma verimliliğine dayalı olarak yaklaşık% 90 ulaşabilirsiniz. Ancak, siRNA&#39;lar etkisi siRNA oligos bozulması nedeniyle uzun süre sonra azalır. Nöronlar 1:01 oranında karıştırılmasıdır 2 plazmid ile birlikte transfekte edilmiş olduğunda, daha küçük boyutu ile plazmit, genellikle daha büyük bir boyutta plazmid göre daha yüksek verim transfeksiyon sahiptir. Ar gibiesult, iki plazmit olan oranı ayarlanması buna göre eş-transfeksiyon verim değişecektir. SiRNA transfeksiyon için, sık sık etiket nöronlara EGFP ile nöronlar birlikte transfekte. SiRNA oligos EGFP çok daha küçük oldukları için, bunların transfeksiyon verimliliği çok daha yüksektir. Bu nedenle, bizim deneylerde genellikle tüm EGFP pozitif nöron da siRNA&#39;lar için olumlu olduğunu düşünüyorum. Periferal aksotomi sonra yetişkin DRG nöronların birçok genetik profil çalışmaları yetişkin DRG nöronların rejenerasyon yeteneği altında yatan inanılmaktadır rejenerasyon ilişkili genler, çok sayıda (bezler) 10-12, tanımlamışlardır. Ancak, yetişkin DRG nöronların akson büyüme aracılık bu paçavra fonksiyonları iyi karakterize edilememiştir. Burada RNAi-aracılı-kaybı fonksiyonu yolla yetişkin DRG nöronlarla akson büyüme aracı olarak, bilinen bir RAG, c-Jun rolü incelenmiştir. Bu yöntemi araştırılmak in vitro aracı değerli bir sağlarte akson rejenerasyonu düzenlenmesinde diğer paçavra rolleri.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> Poli-D-Lizin hidrobromür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td></tr><tr><td> 5-floro-2-deoksipsödoüridin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Üridin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U3003 </td></tr><tr><td> Kollajenaz A </td><td> Roche </td><td> 10103578001 </td></tr><tr><td> TrypLE Express </td><td> Invitrogen </td><td> 12604-013 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 10270-098 </td></tr><tr><td> Penisilin-streptomisin (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122</td></tr><tr><td> GlutaMAX-I (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-038 </td></tr><tr><td> Cam lamelleri (# 1) </td><td> Elektron Mikroskopi bilimler </td><td> 72196-12 </td></tr><tr><td> 24 çukurlu hücre kültürü plakası </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> Steril, distile ve deiyonize su </td><td> Mediatech </td><td> 25-055-CV </td></tr><tr><td> Fare Nöronlar için Nucleofector ve elektroporasyon Kitleri </td><td> Lonza </td><td> VPG-1001 </td></tr><tr><td> C-Jun karşı ON-TARGETplus siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> L-043776 </td></tr><tr><td> Anti - βIII tübülin antikoru (Tuj-1) </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td></tr><tr><td> Altın Antifade montaj çözümü Prolong </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td></tr></tbody&gt; </table>

genetic study of axon regeneration with cultured adult dorsal root ganglion neurons

Biliyorsunuz, merkezi sinir sistemi (MSS) olgun nöronlar olgun MSS 1,2 olarak akson büyüme ve düşmanca bir ortamı desteklemek için azalmış içsel yeteneği nedeniyle yaralanmalar sonra kendi aksonlar rejenere olamaz bilinmektedir. Bunun aksine, periferal sinir sisteminde olgun nöronlar (PNS) yaralanmalar 3 sonra kolaylıkla yeniden. Yetişkin dorsal kök ganglion (DRG) nöronlar da periferik sinir hasarı sonrası sağlam yeniden bilinmektedir. Çevresel hedefler ve omuriliğe uzanan bir merkezi şube innerve eden periferik dalı: Her DRG nöron hücresi soma gelen, hangi dallar iki akson dalları içine bir akson yetişir. Önemli akson rejenerasyonu DRG periferik aksonlar sonuçları Sakatlık, omurilikte aksonlarda ise yaralanma sonrası kötü rejenere. Periferik aksonal yaralanma omurilik yaralanması (bir süreç klima lezyon olarak adlandırılır), aksonlarda rejenerasyon önce oluşur Ancak, greatl olduğunuy 4 artırıldı. Ayrıca, DRG nöronların aksonlarda omurilikte kortikospinal aksonlar inen aynı düşmanca bir ortamda paylaşabilirsiniz. Birlikte, bu yetişkin DRG nöronların akson rejenerasyonu kontrol moleküler mekanizmalar MSS akson rejenerasyonu arttırmak için boyunduruk edilebilir tahminler yapılmıştır. Sonuç olarak, yetişkin DRG nöronlar artık yaygın rejeneratif akson büyüme 5-7 incelemek için bir model sistemi olarak kullanılmaktadır. Burada, in vitro olarak akson rejenerasyon genetik çalışma için kullanılabilir yetişkin DRG nöron kültürü için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu model yetişkin DRG nöronların genetik elektroporasyon-aracılı gen transfeksiyon 6,8 ile manipüle edilir. DNA plazmid veya si / shRNA, bu yaklaşım yetişkin DRG nöronlardan gelen akson büyüme herhangi bir gen-of-ilgi rolünü araştırmak için hem kazanç ve kayıp fonksiyon-deneyleri ile sağlayan nöronlar transferiyle. Nöronlar si / shRNA ile transfekte edilmiş olduğunda, hedeflenen endojen proteinidirgenellikle-kaybı fonksiyon testlerinde daha az etkili hale, zaman sağlam akson büyüme zaten ortaya sırasında kültür 3-4 gün sonra tükendi. Bu problemi çözmek için, burada tarif edilen yöntem aksonlardan hedef proteinin yokluğunda nöronlar den yeniden büyümesini sağlar transfeksiyon sonrasında yeniden süspansiyon ve re-kaplama adımı da içerir. Son olarak, yetişkin DRG nöronların 9 akson büyüme aracı bir akson rejenerasyonu ile ilişkili gen, c-Jun, rolünü incelemek için in vitro model bu kullanarak bir örnek sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons at JoVE.com

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Bir<em&gt; In vitro</emKültürlü yetişkin fare dorsal kök ganglion nöronlar ile akson rejenerasyonu genetik çalışma için&gt; modeli açıklanmıştır. Metodu genetik manipülasyon geçiren nöronlarla akson yeniden büyümesini izin vermek için bir re-suspension/re-plating adım içerir. Bu yaklaşım, RNAi bazlı protein Knockdown kullanarak akson rejenerasyonu kaybı fonksiyon-çalışmaları için özellikle yararlıdır.

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

genetic-study-axon-regeneration-with-cultured-adult-dorsal-root

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.5K Görüntüleme.  Johns Hopkins University School of Medicine. Bir In vitro modeli açıklanmıştır. Metodu genetik manipülasyon geçiren nöronlarla akson yeniden büyümesini izin vermek için bir re-suspension/re-plating adım içerir. Bu yaklaşım, RNAi bazlı protein Knockdown kullanarak akson rejenerasyonu kaybı fonksiyon-çalışmaları için özellikle yararlıdır.

Video: Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Nörobilim

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

Sırt kök ganglion Modeli: Kanserli Sinir Invasion Vitro Modelleme

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Sırt kök ganglion Enjeksiyon ve Dorsal Kök Duyusal Axon Rejenerasyon Modeli Olarak Ezilme Yaralanması

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Lomber Dorsal kök gangliyon erişim ve domuz yerleştirmeye laminotomy

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Soruşturma memeli Axon rejenerasyon: Vivo Elektroporasyon yetişkin fare Dorsal kök gangliyon

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for nerve fibers in the central and peripheral nervous systems. This method is particularly applicable to dorsal root ganglia (DRG), which are primary sensory neurons that exhibit a pseudo-unipolar structure of nervous processes. The patterns and features of the action potentials passed along axons are recordable in these neurons. The present study uses in vivo single-fiber recordings to observe the conduction failure of sciatic nerves in complete Freund&#8217;s adjuvant (CFA)-treated rats. As the underlying mechanism cannot be studied using in vivo single-fiber recordings, patch-clamp-recordings of DRG neurons are performed on preparations of intact DRG with the attached sciatic nerve. These recordings reveal a positive correlation between conduction failure and the rising slope of the after-hyperpolarization potential (AHP) of DRG neurons in CFA-treated animals. The protocol for in vivo single fiber-recordings allows the classification of nerve fibers via the measurement of conduction velocity and monitoring of abnormal conditions in nerve fibers in certain diseases. Intact DRG with attached peripheral nerve allows observation of the activity of DRG neurons in most physiological conditions. Conclusively, single-fiber recording combined with electrophysiological recording of intact DRGs is an effective method to examine the role of conduction failure during the analgesic process.

Single-fiber recording is an effective electrophysiological technique that is applicable to the central and peripheral nervous systems. Along with the preparation of intact DRG with the attached sciatic nerve, the mechanism of conduction failure is examined. Both protocols improve the understanding of the peripheral nervous system&#39;s relationship with pain.

İletim Yetmezliği Mekanizmasını İncelemek Için Bağlı Siyatik Sinir ile In Vivo Tek Lifli Kayıt ve Bozulmamış Dorsal Kök Ganglion Kullanımı

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Dorsal Kök Ganglion Makrofajlarının Hızlı İzolasyon

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir