Bu yöntem, karaciğer gelişimi, rejenerasyon ve kronik hastalık çalışmaları için 2D doku bölümlerinden hepatosit nükleer DNA içeriği nin bir profil oluşturmak için kullanıcı sağlar. Bu otomatik yüksek iş elde etme yaklaşımı tüm 2D karaciğer dokusu bölümleriuygulanabilir, tüm basit dairesel hepatosit çekirdekleri için nükleer ploidi bir iç kalibre okuma sağlayan. Hepatosit nükleer ploidi değişiklikler yaşlanma ile ilişkilidir, kronik karaciğer hastalığı, ve kanser.
Bu teknik, sabit veya kriyokorunmuş karaciğer örneklerinde nükleer ploidin profilini çıkarmak için basit bir araç sağlar. Onlar doku ayrıştırma veya taze malzeme erişimi gerektirmez gibi yerinde ploidy profilleme yöntemleri karaciğer hastalığı ilerlemesini izlemek için araştırma ve klinik araçlar olarak önemli bir potansiyele sahiptir. Murine karaciğer doku örneği hasat sonra, optimal bir kesme sıcaklığı orta dolu kriyomold içine karaciğer lobule gömmek ve hızlı donma sağlamak için hemen kuru buz üzerine kalıp yerleştirin.
Dondurulmuş karaciğer lobule örneğinin dilimlerini elde etmek için, numuneyi altı mikrometre kalınlıkta keserek, her numunenin slayta yapışmasını sağlamak için beş saniye boyunca her numunenin üzerine etiketlenmiş poliamid kaplı bir slayt yerleştirin. Tüm dilimler toplandığında, immünetiketlemeden önce numunelerin oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca dengede olmasını bekleyin. Dengenin sonunda, pbs%4 paraformaldehit bir mililitre ile bir duman kaputiçinde doku bölümleri düzeltmek oda sıcaklığında 10 dakika.
Fiksasyonun sonunda, pbs üç üç dakikalık yıkıntıları ile nazik ajitasyon ile slaytlar durula. Son yıkamadan sonra, her doku bölümü etrafında alan kuru ve her örnek etrafında bir daire çizmek için bir hidrofobik kalem kullanın. Numuneleri permeabilize etmek için, bölümleri PBS'de %0,5 iyonik olmayan yüzey aktif madde ile oda sıcaklığında 15 dakika tedavi edin.
Kuluçka sonunda, numuneleri PBS'de üç dakika boyunca hafif ajitasyonla iki kez yıkayın ve spesifik olmayan bağlamayı %1 büyükbaş serum albumen, %5 at serumu ve PBS'de en az bir saat boyunca %0,2 iyonik olmayan yüzey aktif bir çözelti ile bloke etmeden önce gösterdi. Daha sonra, ışıktan korunan nemli bir boyama odasında bir gecede dört santigrat derecede tampon engelleme seyreltilmiş HHF4-alfa antikor ile slaytlar inkübed. Ertesi sabah, uygun bir floresan konjuge ikincil antikor ve Hoechst filtrelenmiş 1% sığır serum albumen seyreltilmiş ve% 0.2 Non-iyonik yüzey aktif madde ile kuluçka önce nazik ajitasyon ile PBS dört kez slaytlar yıkayın.
Kuluçka sonunda, slaytları gösterildiği gibi dört kez yıkayın, ardından iki üç dakikalık yıkama lar çift distile suda nazik ajitasyon ile. Son yıkamadan sonra, numuneleri iki damla floresan montaj ortamıyla bir kapak kaymasına yerleştirin ve kabarcıkları ortadan kaldırmak için gerektiği kadar hafif basınç uygulayın. Daha sonra, iyi bir fiksasyon ve immün etiketleme sağlamak için geleneksel floresan mikroskop kullanarak slaytlar kontrol edin.
Floresan görüntü edinimi için, kullanılan floresan için uygun uyarma kullanarak floresan görüntüleri elde etmek için yüksek içerikli görüntüleme platformunda parametreleri ayarlayın. Daha sonra doku bölümünün tam kapsama almak için yeterli görüntü elde etmek için örnekleri tazyin. Taramayı sonunda, çekirdeğin en iyi şekilde ayrıştırılmasından emin olmak için yazılımın nükleer segmentasyon parametrelerini ayarlayın ve HNF4-alfa pozitif hepatositler ve HNF4-alfa negatif negatif parenkimal olmayan hücrelerin optimal gating sağlamak için eşik yoğunluğunu değiştirin.
Nükleer niceleme için, Hoechst boyama dayalı kare mikrometreler halinde nükleer alan ayarlayın, ana nükleer Hoechst yoğunluğu, nükleer uzama faktörü, ortalama nükleer yuvarlaklık indeksi, HNF4-alfa durumu, ve nükleer X, Yerçekimi merkezine dayalı Y koordinatları. Hepatosit nükleer ploidi analizi yapmak için, ilk indirin ve ploidy nicelik analizi programı yükleyin. MATLAB'da, araç şeridinin Uygulama sekmesine gidin ve Uygulamayı Yükle'yi tıklatın.
Ploidy Application ML Uygulama Yükleme programını açın. Başarılı yüklemeyi onaylamak için bir ileti görüntülenir. Her veri analizi dosyasında, belirtildiği gibi sütunlar halinde belirlenen ploidy analizi için gerekli tüm verileri içeren hücre ölçüleri olarak adlandırılan bir sayfa içerir.
Her deneysel durum için, iki ila dört N nükleer ploidy kalibrasyonu için iç kontrolü hesaplamak için kullanılacak bir kontrol veri seti sağlayın. Biyolojik çoğaltmalar için, her elektronik tabloyu kendi klasöründe depolayın ve klasör öneklerini artımlı olarak adlandırın. Sonra, Ploidy uygulamasını başlatın.
Ploidy uygulaması grafik kullanıcı arabirimi görünür. Denetim verilerinin bulunduğu klasöre gitmek için Veri Yolu düğmesini tıklatın. Bu veri yolu daha sonra arabirimde görünür.
Klasör Öneki'nde, çıktı dosyalarına verilecek adı yazın. Diğer Verilere Giden Yol düğmesini tıklatın ve karşılaştırmalı verilerin çoğaltıldığı klasöre gidin. Bu veri yolu daha sonra arabirimde görünür.
Ardından Çalıştır'ı tıklatın. Çözümleme tamamlandığında Durum çubuğu Çözümlemesi Tamamla'yı okuyacaktır. İmmünetiketlemeden sonra, kaliteli bir fiksasyon ve boyama elde edildiğini doğrulamak için konvansiyonel floresan mikroskobu ile tüm slaytların kontrol edilmesi önemlidir.
Hoechst boyasının bulaşması veya bulanıklaşması fiksasyon dan önce yetersiz fiksasyon veya örnek bozulmasını gösterebilir. Nükleer segregasyon ve HNF4-alfa eşik parametreleri, floresan mikroskopi ile gözlenen immünboyamanın görsel desenini geniş ölçüde yansıtacak şekilde otomatik görüntü analizi öncesinde dikkatle optimize edilmelidir. Görüntü analizini takiben, veriler artan sayıda parankimal olmayan hücre sayısını ve DDC yaralanması olan karaciğer içindeki HNF4-alfa pozitif çekirdek sayılarında küçük ama önemli olan azalmayı yansıtmalıdır.
Sağlıklı kontrol karaciğerlerinde HNF4-alfa pozitif çekirdeklerin yaklaşık %63'ü basit dairesel morfometri ye sahiptir. Kontrol ve DDC tedavi grupları arasında göreceli nükleer ploidin karşılaştırılması 8C'den büyük hücrelerin artan sayıları ile birlikte yaralanma ile 2C ve 4C hepatosit çekirdekleri önemli bir kaybı yansıtmalıdır. Her ploidy alt grup için göreli konumsal bilgiler yüksek içerik görüntü analizi yazılımı içinde belirli hepatosit alt kümeleri 2D konumu alınarak sorgulanabilir.
Ki-67 gibi ek antikorlarla immünoetiketleme, hücre replikasyonlarını değerlendirmek için yapılabilir ve hepatosit nükleer morfometri verileri ploidi analizini iltifat etmek için daha fazla sorgulanabilir. Bu yöntemle oluşturulan doku çapında ploidi profili tüm dairesel hepatosit çekirdekleri için minimum DNA içeriğini açıklar, ancak mononükleer hücreler ve binükleer hepatositler arasında ayrım yapmaz. Yöntem potansiyel olarak hücre çevresi gibi parametrelere göre uyarlanabilir, binükleer hücrelerin tanımlanmasını kolaylaştırmak ve hücresel ploidi ek bir okuma sağlamak için.
