Este método permite que o usuário gere um perfil de teor de DNA nuclear hepatocito a partir de seções de tecido 2D para o estudo do desenvolvimento hepático, regeneração e doença crônica. Esta abordagem automatizada de alta produtividade pode ser aplicada a todas as seções de tecido hepático 2D, fornecendo uma leitura internamente calibrada da ploidia nuclear para todos os núcleos de hepatocitos circulares simples. Mudanças na ploidia nuclear hepatocita estão associadas ao envelhecimento, doença hepática crônica e câncer.
Esta técnica fornece um meio simples de traçar ploidy nuclear em amostras de fígado fixas ou criopreservadas. Os métodos de criação de perfil no situ ploidy têm um potencial considerável como pesquisas e ferramentas clínicas para rastrear a progressão da doença hepática, pois não requerem desagregação tecidual ou acesso a material fresco. Depois de colher a amostra de tecido hepático murino, incorpore o lobule do fígado em um criomold de temperatura de corte ideal e coloque imediatamente o molde em gelo seco para garantir o congelamento rápido.
Para obter fatias da amostra de lobule de fígado congelado, se sectionie a amostra com uma espessura de seis micrômetros, colocando um slide revestido de poliamida rotulado sobre cada amostra por cinco segundos para deixar cada amostra grudar no slide. Quando todas as fatias tiverem sido coletadas, permita que as amostras se equilibrem por três a cinco minutos à temperatura ambiente antes da imunolabelação. No final do equilíbrio, fixar as seções teciduais em um capô de fumaça com um mililitro de 4% de paraformaldeído em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente.
No final da fixação, enxágue os slides com três lavagens de três minutos em PBS com agitação suave. Após a última lavagem, seque a área ao redor de cada seção de tecido e use uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo em torno de cada amostra. Para permeabilizar as amostras, trate as seções com um surfactante 0,5% não iônico na PBS por 15 minutos à temperatura ambiente.
Ao final da incubação, lave as amostras por três minutos em PBS duas vezes com agitação suave como demonstrado antes de bloquear a ligação não específica com uma solução filtrada de 1%de gêrio bovino, soro de 5% de cavalo e surfactante não iônico de 0,2% na PBS por pelo menos uma hora a temperatura ambiente. Em seguida, incubar os slides com o anticorpo HHF4-alfa diluído no bloqueio de tampão durante a noite a quatro graus Celsius em uma câmara de coloração úmida protegida da luz. Na manhã seguinte, lave os slides quatro vezes na PBS com agitação suave antes da incubação com um anticorpo secundário conjugado fluorescência apropriado e Hoechst diluído em albumen de soro bovino filtrado de 1% e 0,2% surfactante não iônico na PBS por duas horas à temperatura ambiente em uma câmara de coloração úmida protegida da luz.
No final da incubação, lave os slides quatro vezes como demonstrado, seguido por duas lavagens de três minutos em água dupla destilada com agitação suave. Após a última lavagem, monte as amostras com duas gotas de fluorescência em um deslizamento de cobertura e aplique pressão suave conforme necessário para eliminar quaisquer bolhas. Em seguida, verifique os slides usando um microscópio de fluorescência convencional para garantir uma boa fixação e imunolabelação.
Para aquisição de imagens de fluorescência, defina os parâmetros em uma plataforma de imagem de alto conteúdo para adquirir imagens de fluorescência usando a excitação apropriada para os fluoroforos utilizados. Em seguida, digitalize amostras para adquirir imagens suficientes para obter cobertura completa da seção tecidual. No final da varredura, ajuste os parâmetros de segmentação nuclear do software para garantir que os núcleos sejam bem segregados e modifique a intensidade do limiar para garantir o gating ideal dos hepatócitos positivos HNF4-alfa e células não-parenchímicas HNF4-alfa.
Para quantificação nuclear, coloque a área nuclear em micrômetros quadrados com base na coloração de Hoechst, a intensidade principal de Hoechst nuclear, o fator de alongamento nuclear, o índice médio de arredondamento nuclear, o status HNF4-alfa, e as coordenadas nucleares X, Y baseadas no centro de gravidade. Para realizar uma análise de ploidia nuclear hepatocita, primeiro baixe e instale o programa de análise de quantificação ploidy. No MATLAB, navegue até a guia App da faixa de ferramentas e clique em Instalar Aplicativo.
Abra o programa de instalação de aplicativos ML do aplicativo Ploidy. Uma mensagem aparecerá para confirmar a instalação bem sucedida. Em cada arquivo de análise de dados, inclua uma folha denominada Medidas Celulares, contendo todos os dados necessários para a análise ploidy estabelecida em colunas conforme indicado.
Para cada condição experimental, forneça um conjunto de dados de controle que será usado para calcular o controle interno para a calibração de ploidia nuclear de dois a quatro N. Para réplicas biológicas, armazene cada planilha em sua própria pasta, nomeando os prefixos da pasta incrementalmente. Em seguida, inicie o aplicativo Ploidy.
A interface gráfica do usuário do aplicativo Ploidy aparecerá. Clique no botão Caminho para Controlar dados para navegar até a pasta na qual os dados de controle se replicam residem. Esse caminho de dados aparecerá na interface.
No Prefixo de pasta, digite o nome a ser dado aos arquivos de saída. Clique no botão Caminho para Outros Dados e navegue até a pasta na qual os dados comparativos se replicam residem. Esse caminho de dados aparecerá na interface.
Em seguida, clique em Executar. Quando a análise estiver concluída, a barra de status lerá a análise completa. Após a imunolabelação, é importante verificar todos os slides por microscopia de fluorescência convencional para confirmar que uma boa fixação de qualidade e coloração foi obtida.
A mancha ou a desfoque do corante Hoechst podem indicar fixação inadequada ou degradação da amostra antes da fixação. Os parâmetros de segregação nuclear e limiar HNF4-alfa devem ser cuidadosamente otimizados antes da análise automática de imagens para refletir amplamente o padrão visual da imunostaining observada pela microscopia de fluorescência. Após a análise da imagem, os dados devem refletir o número crescente de células não parenchímicas e a pequena, mas significativa, redução dos números de núcleos positivos HNF4-alfa dentro do fígado com lesão DDC.
Em fígados de controle saudável, aproximadamente 63% dos núcleos HNF4-alfa positivos exibem uma simples morfometria circular. A comparação da ploidia nuclear relativa entre os grupos tratados de controle e DDC deve refletir uma perda significativa dos núcleos hepatócitos 2C e 4C com lesões, juntamente com o aumento do número de células maiores que 8C. As informações posicionais relativas para cada subgrupo ploidy podem ser interrogadas recuperando a localização 2D de subconjuntos de hepatócitos específicos dentro do software de análise de imagem de alto conteúdo.
A imunolabelagem com anticorpos adicionais, como o Ki-67, pode ser realizada para avaliar a replicação celular e os dados de morfometria nuclear hepatócito podem ser interrogados para complementar a análise de ploidy. O perfil de ploidia em todo o tecido gerado por este método descreve o conteúdo mínimo de DNA para todos os núcleos hepatócitos circulares, mas não discrimina entre células mononucleares e hepatócitos binucleares. O método pode potencialmente ser adaptado para explicar parâmetros como perímetro celular, para facilitar a identificação de células binucleares e fornecer uma leitura adicional da ploidia celular.
