Bu araştırma SS'ye ERA-CVD-2019 ve ANR-JCJC-2020 tarafından desteklenmiştir. U 1251/Marsilya Tıbbi Genetik laboratuvarından Genomik ve Biyoinformatik tesisine (GBiM) ve değerli yorumlar sağlayan isimsiz hakemlere teşekkür ederiz.

Bu çalışmada benimsenen hayvan prosedürü, Aix-Marseille Üniversitesi (C2EA-14) hayvan etik kurulları tarafından onaylanmış ve hayvan deneyleri için atanmış ulusal etik kurul (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Yetkilendirme Apafis N°33927-2021111715507212).
1. Diseksiyondan önce zamanlanmış çiftleşmenin ayarlanması
<ol><li>Fare embriyoları oluşturmak için, kalp bölgesi izolasyonundan 9,5 gün önce yetişkin fareler arasında zamanlanmış bir çiftleşme gerçekleştirin. Bu prosedürde, 2-6 aylık vahşi tip C57BL / 6J fareler kullanıldı ve gece boyunca zamanlanmış çiftleşme yapıldı.</li>
	<li>Ertesi sabah, dişi farelerin vajinal tıkacı olup olmadığını kontrol edin. Fişin embriyonik gün (E) 0.5 olarak tanımlandığı günü düşünün.</li>
</ol>2. Doku hazırlığı ve hücre izolasyonu
<ol><li>2-6 aylık hamile kadın C57BL/6J'yi CO2 yoluyla gebe kaldıktan sonra 9.5. günde artan konsantrasyon ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapın. Karnın alt kısmını% 70 etanol ile temizleyin. NOT: Servikal çıkıktan önce anesteziklerin kullanılması önerilmez, çünkü bu, embriyoları sonraki transkriptomik ve epigenomik çalışmaları etkileyebilecek çevresel değişikliklere maruz bırakacaktır.</li>
	<li>Karın ve periton makasla açın. Rahim boynuzlarını görselleştirin ve her iki boynuzu da çıkarmak için forseps kullanın.</li>
	<li>Boynuzları% 1 FBS ile soğuk komple ortam içeren bir Petri kabına yerleştirin. Belirli bir hacim gerekmese de, embriyoların ortama tamamen daldırıldığından emin olmak için özen gösterilmelidir. 10 cm Petri kabı başına yaklaşık 10 mL'lik bir hacim uygundur.</li>
	<li>5x büyütmede ayarlanmış stereomikroskop altında ve forseps kullanarak, endometriyal dokuyu, plasentayı ve yumurta sarısı kesesini her embriyodan çıkarın.</li>
	<li>Embriyoları% 1 FBS ile soğuk komple ortama sahip bir Petri kabına yerleştirin. Embriyonik kalp bölgesini, Şekil 1'de gösterilen şematik embriyoda tarif edildiği gibi, soğuk tam ortamda diseke edin.</li>
	<li>Beş fare embriyosundan disseke edilen kalp bölgelerini 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde bir araya getirin. Ön soğutma sallanan kova santrifüjleri 4 °C'ye kadar santrifüjler.</li>
	<li>Sallanan kovalı bir santrifüjde RT'de 1 dakika boyunca 300x g'de santrifüj. Süpernatanı çıkarın ve 1 mL doku kültürü dereceli PBS ekleyerek dokuları yıkayın.</li>
	<li>RT'de 1 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Süpernatanı çıkarın ve toplam iki yıkama için yıkama adımlarını tekrarlayın. PBS'yi %0,05 tripsin/EDTA (1x) ile değiştirerek yıkamayı iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Doku sindirimi için, 37 ° C'de 10 dakika boyunca 50 μL% 0.25 tripsin / EDTA ekleyin. Geniş delikli bir filtre ucu kullanarak 5 dakika sonra yukarı ve aşağı hareketlerle nazik mekanik ayrışma uygulayın.</li>
	<li>Ayrışmış hücrelere 350 μL tam ortam ekleyerek tripsin sindirim aktivitesini inaktive edin. Yeniden askıya alınan hücreleri 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.</li>
</ol>3. Hücre sayımı ve canlılık değerlendirmesi
NOT: Hücre sayısı ve canlılığı, tek hücreli deneylerin başarısı için kritik parametrelerdir. snATAC-seq yaklaşımı, hücre sayısındaki küçük değişikliklere duyarlıdır. Çok az hücre, kromatinin aşırı sindirilmesine neden olur, bu da daha fazla sayıda okuma ve erişilemeyen kromatin bölgelerinin haritalanmasına (gürültü) neden olur. Benzer şekilde, çok fazla hücreye sahip olmak, sıralanması zor olan yüksek moleküler ağırlıklı parçalar üretir. Hücre ve çekirdek konsantrasyonlarının doğru bir şekilde belirlenmesi için, hücre sayısı ve canlılığı iki farklı yöntemle değerlendirildi.
<ol><li>Aşağıda açıklandığı gibi hücre sayımı için bir tripan mavisi testi yapın.<ol><li>Vorteks% 0.4 tripan mavisi boyama çözeltisi, 2.000 x g'de oda sıcaklığında 10 s boyunca döndürün ve 10 μL'yi bir mikrotüpe aktarın.</li>
		<li>Bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu karıştırın ve önceden alıntılanmış 10 μL tripan mavisi çözeltisine 10 μL süspansiyon ekleyin. Bir pipetle 10 kez dikkatlice karıştırın.</li>
		<li>Boyanmış hücrelerin 10 μL'sini bir sayım slaytına aktarın. Hücre konsantrasyonunu ve canlılığını otomatik olarak hesaplamak için slaytı sayaca yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıda açıklandığı gibi floresan bazlı bir mortalite değerlendirmesi yapın. NOT: Bu tahlil, hücre canlılığını değerlendirmek için floresan boyaların (ethidyum homodimer-1, EthD-1 ve kalsein) kullanımına dayanmaktadır. Ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanıldı ve uygun hazırlık ve kullanım için sağlayıcının talimatlarına uyuldu.<ol><li>1 mL steril doku kültürü sınıfı D-PBS'ye birlikte verilen 2 mM EthD-1 stok çözeltisinin 5 μL'sini ekleyerek 10 μM EthD-1 çözeltisi hazırlayın ve tam karıştırmayı sağlamak için 5 sn boyunca vorteks yapın.</li>
		<li>Birlikte verilen 4 mM kalsein stok çözeltisinin 2,5 μL'sini önceden hazırlanmış EthD-1 çözeltisine aktarın. Tam karıştırma sağlamak için 5 sn vorteks.</li>
		<li>Elde edilen 10 μM EthD-1 ve 10 μM kalsein çalışma çözeltisinden 10 μL'sini 10 μL hücre süspansiyonuna ekleyin. NOT: Kalsein, sulu çözeltilerde hidrolize karşı oldukça hassastır, bu nedenle bu çalışma solüsyonunu 1 gün içinde kullanın.</li>
		<li>Boyanmış hücrelerin 10 μL'sini bir sayım slaydı üzerine aktarın. Slaytı otomatik floresan hücre sayacına yerleştirin. GFP filtresi kullanarak canlı hücreleri ve RFP filtresi kullanarak ölü hücreleri sayın. NOT: İki sayım yöntemi benzer hücre sayıları ve canlılığı verdi ve yeni ayrışmış hücrelerin toplam sayısının embriyonik kalp bölgesi başına ortalama 20.000 hücre (0.06mm3) olduğu tahmin edildi.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Hücre dondurma
<ol><li>Hücre süspansiyonunu 500 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı tüpün dibine dokunmadan dikkatlice çıkarın ve peleti 1 mL soğutulmuş dondurma ortamında tekrar askıya alın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu önceden soğutulmuş bir kriyovyal içine aktarın ve kriyovali önceden soğutulmuş bir dondurma kabına yerleştirin.</li>
	<li>Kabı 4 saat ila 8 saat boyunca −80 ◦C'ye yerleştirin. Aşağı akış tek çekirdekli RNA ve ATAC dizileme deneyleri için kriyovyal sıvı azota aktarın. NOT: Kriyoviyal kullanımdan önce kuru buz üzerinde taşınmalıdır. Deneyimlerimize göre, hücreler hücre canlılığı kaybı olmadan en az 6 ay boyunca sıvı azotta saklanabilir. Buz kristallerinin oluşumunu önlemek için depolama sıcaklığı her zaman -150 ° C'nin altında tutulmalıdır.</li>
</ol>5. Hücre çözülmesi ve ölü hücrelerin çıkarılması
<ol><li>Kriyovyalleri 1-2 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Kriyoviyalde küçük bir kristal kaldığında çıkarın.</li>
	<li>1 mL önceden ısıtılmış (37 °C) tam ortam ekleyin. Bir pipetle üç kez karıştırın. Süspansiyonu, 10 mL sıcak tam ortam içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.</li>
	<li>Tüm hücre süspansiyonunu 30 μm'lik bir süzgeçten geçirin. Süzgeci 1-2 mL ılık tam ortam ile durulayın ve akışı aynı konik tüpte toplayın.</li>
	<li>5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. PBS ile bir kez yıkayın ve hücre süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.</li>
	<li>5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve hücre topağını bozmadan süpernatantı çıkarın.</li>
	<li>Peletlenmiş hücrelere sağlanan manyetik mikroboncuklardan 100 μL ekleyin ve geniş delikli bir pipet ucu kullanarak beş kez homojenize edin. RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Bu arada, manyetik ayırma kolonunu (kapasite: 1 x 107 ila 2 x 108 hücre) 500 μL 1x bağlama tamponu ile durulayın.</li>
	<li>İnkübasyon tamamlandıktan sonra, mikroboncukları içeren hücre süspansiyonunu 500 μL 1x bağlayıcı tampon ile seyreltin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu (0.6 μL) hazırlanan manyetik ayırma kolonuna uygulayın. Akış, negatif olarak seçilmiş canlı hücre fraksiyonudur ve manyetik olarak tutulan fraksiyon, pozitif olarak seçilen ölü hücrelerdir.</li>
	<li>Canlı hücre atık suyunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. Hücre süspansiyonunu içeren 1,5 mL mikrotüpü ve sütunu 2 mL 1x bağlama tamponu ile durulayın ve atık suyu aynı 15 mL tüpte toplayın.</li>
	<li>5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Hücre topağını bozmadan süpernatantı çıkarın.</li>
	<li>PBS-BSA çözeltisinden 1 mL ekleyin ve geniş delikli pipet ucu kullanarak beş kez pipetleyerek hafifçe karıştırın. Hücre süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.</li>
	<li>5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Hücre topağını bozmadan süpernatantı çıkarın.</li>
	<li>Peletin yeniden askıya alınması için 1 mL PBS-BSA ekleyin ve toplam iki yıkama için yıkama adımını tekrarlayın.</li>
	<li>Hücreleri 100 μL PBS-BSA çözeltisinde yeniden askıya alın. 10 kez pipetleyerek hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Daha önce açıklanan yöntemleri kullanarak hücrelerin konsantrasyonunu ve canlılığını belirleyin (adım 3.1 ve adım 3.2). Bir sonraki adıma geçmek için, hücre sayısının ≥100.000 hücre olduğundan emin olun. Temsili sonuçlar için Şekil 2'ye bakın. NOT: Kriyoprezervasyon, canlı hücrelerin ilk başlangıç materyalinin yaklaşık% 40'ının kaybına neden olur. Başlangıç hücre sayısına bağlı olarak, manyetik bir sütun üzerindeki boncuk ayrımı yüksek hücre canlılığı ile sonuçlanır, ancak toplam hücre sayısını iki kat ila beş kat arasında böler. Ölü hücreleri çıkarmak için kolon tabanlı bir manyetik kitin kullanılması, yalnızca yeterli başlangıç malzemesi mevcut olduğunda tavsiye edilir.</li>
</ol>6. Çekirdek izolasyonu
NOT: snATAC ve snRNA-seq kombine temiz ve sağlam çekirdeklerin süspansiyonu ile gerçekleştirilir. Kullanılan hücre tipi için lizis koşullarının (lizis süresi ve NP40 konsantrasyonu) optimizasyonu önerilir. En uygun lizis zaman noktası ve deterjan konsantrasyonu, nükleer morfolojiyi bozmadan maksimum sayıda hücrenin lize edilmesine neden olanlardır. Hücre/çekirdek kaybı, sabit açılı santrifüj yerine sallanan kovalı santrifüj kullanılarak azaltılabilir. Plastiklerde çekirdek tutulmasını en aza indirmek için, düşük retansiyonlu pipet uçlarının ve santrifüj tüplerinin kullanılması önerilir. Bu, çekirdek geri kazanımını artırabilir. Pipet uçlarının ve santrifüj tüplerinin %5 BSA ile kaplanması daha ucuz ancak daha fazla zaman alan bir alternatiftir.
<ol><li>Çalışma yerini ve malzemeleri% 70 etanol ve RNaz giderici çözelti ile temizleyin.</li>
	<li>Ön soğutma sallanan kova santrifüjleri 4 °C'ye kadar santrifüjler. Lizis tamponu, lizis seyreltme tamponu, 0.1x lizis tamponu ve yıkama tamponunu taze hazırlayın (bakınız Tablo 1). Tamponları buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 500 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca sallanan kovalı bir santrifüjde santrifüjleyin. Hücre topağının yerinden çıkmasını önlemek için tüpün dibine dokunmadan tüm süpernatantı yavaşça çıkarın.</li>
	<li>100 μL soğutulmuş 0.1x lizis tamponu ekleyin. 10 kez pipetleyerek hafifçe karıştırın. Buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>1 mL soğutulmuş yıkama tamponu ekleyin ve beş kez pipetleyerek yavaşça karıştırın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj. Çekirdek topağını bozmadan süpernatantı çıkarın.</li>
	<li>Soğutulmuş yıkama tamponu ile yıkamaları toplam üç yıkama için tekrarlayın. Seyreltilmiş çekirdek tamponunu hazırlayın. Yeniden süspansiyondan sonra, çekirdek stok çözeltisini buz üzerinde tutun.</li>
</ol>7. İzole edilen çekirdeklerin kalite ve miktar değerlendirmeleri
NOT: İlk hücre sayısına dayanarak ve hücre lizisi sırasında yaklaşık% 50 çekirdek kaybını tahmin ederek, soğuk seyreltilmiş çekirdek tamponunda uygun sayıda hücreyi yeniden askıya alın. Soğutulmuş seyreltilmiş çekirdek tamponu ile yeniden süspansiyon hacminin hesaplanması, hedeflenen çekirdek geri kazanımına ve üreticinin kullanım kılavuzu tarafından önerilen ilgili çekirdek stok konsantrasyonlarına dayanır. Ek Protokol 1'de bu hesaplamanın bir örneğine bakın.
<ol><li>İlk hücre sayısına dayanarak ve hücre lizisi sırasında yaklaşık% 50 çekirdek kaybını tahmin ederek, soğuk seyreltilmiş çekirdek tamponunda uygun sayıda hücreyi yeniden askıya alın.</li>
	<li>Gerçek çekirdek konsantrasyonunu belirleyin. 2 μL çekirdek stok çözeltisini 8 μL seyreltilmiş çekirdek tamponu ile karıştırın ve karışımı önceden alıntılanmış 10 μL tripan mavisi veya EthD-1/calceinAM çalışma çözeltisine ekleyin. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak çekirdekleri sayın. Hücrelerin% 5'inden azı canlı olmalıdır. Temsili sonuçlar için Şekil 3'e bakın.</li>
	<li>Transpozisyon reaksiyonu için önerilen konsantrasyonda toplam 5 μL hacim elde etmek için çekirdek stoğunun hacmini ve seyreltilmiş çekirdek tamponunun hacmini hesaplayın (üreticinin kullanım kılavuzuna bakın). Hemen kullanım kılavuzu17'ye göre transpozisyon reaksiyonuna geçin. NOT: Transpozisyon reaksiyonundan ATAC ve GEX kütüphanelerinin inşasına kadar tüm adımlar, snRNA-seq ve snATAC-seq kombine17 için kullanılan kitin kullanım kılavuzuna göre gerçekleştirilmiştir.</li>
</ol>8. snRNA-seq ve snATAC-seq kütüphanelerinin kalite analizi
<ol><li>Yeni nesil dizilemeye geçmeden önce, son snATAC-seq ve gen ekspresyonu GEX kütüphanelerinin kalite ve boyut dağılımını doğrulayın. Parça analiz sistemlerini kullanarak kütüphanelerde tanımlanan dizilerin kalitesini ve miktarını değerlendirin. Temsili kalite değerlendirme sonuçları için Şekil 4'e bakınız. NOT: snATAC-seq kütüphanelerinin son izi, nükleozom sargısının periyodikliğini göstermeli ve boyutlar 200 bp ile birkaç Kbp arasında değişmeli, oysa gen ekspresyon kütüphanesindeki boyutlar 300 bp ila 600 bp arasında değişmelidir.</li>
</ol>

Tek Hücre Çözünürlüğünde Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

<ol>
	<li>vander Bom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+epidemiology+of+congenital+heart+disease.">The changing epidemiology of congenital heart disease.</a> Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).</li><li>Bouma, B. J., Mulder, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+landscape+of+congenital+heart+disease.">Changing landscape of congenital heart disease.</a> Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).</li><li>Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+congenital+heart+disease:+The+contribution+of+the+noncoding+regulatory+genome.">Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome.</a> Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).</li><li>Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+heart.">Development of the human heart.</a> American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).</li><li>Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+heart.">Development of the human heart.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).</li><li>Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomes+in+the+heart:+When+every+epigenome+counts.">Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts.</a> Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).</li><li>Tanay, A., Regev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+single-cell+genomics+from+phenomenology+to+mechanism.">Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism.</a> Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).</li><li>Schwartzman, O., Tanay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+epigenomics:+Techniques+and+emerging+applications.">Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications.</a> Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).</li><li>Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiomics:+Multiple+measurements+from+single+cells.">Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells.</a> Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide.">ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).</li><li>Stefanovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox-dependent+coordination+of+mouse+cardiac+progenitor+cell+patterning+and+differentiation.">Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation.</a> Elife. 9, e55124 (2020).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plate-based+single-cell+ATAC-seq+workflow+for+fast+and+robust+profiling+of+chromatin+accessibility.">A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility.</a> Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).</li><li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation.">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li><li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows.">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).</li><li>Safabakhsh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+nuclei+from+frozen+human+heart+tissue+for+single-nucleus+RNA+sequencing.">Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing.</a> Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).</li><li>Pimpalwar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+and+transcriptional+profiling+of+individual+cells+from+the+human+heart.">Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart.</a> Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).</li><li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromium+Next+GEM+Single+Cell+Multiome+ATAC+++Gene+Expression+Reagent+Kits+User+Guide.">Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide.</a> 10x Genomics. , (2022).</li><li>Jia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+RNA-seq+and+ATAC-seq+analysis+of+cardiac+progenitor+cell+transition+states+and+lineage+settlement.">Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement.</a> Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+dual-omics+reveals+the+transcriptomic+and+epigenomic+diversity+of+cardiac+non-myocytes.">Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes.</a> Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+gene+regulatory+networks+underlying+murine+neonatal+heart+regeneration+at+single-cell+resolution.">Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution.</a> Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).</li><li>Ameen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+single-cell+analysis+of+cardiogenesis+identifies+developmental+trajectories+and+non-coding+mutations+in+congenital+heart+disease.">Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease.</a> Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pioneering+function+of+Isl1+in+the+epigenetic+control+of+cardiomyocyte+cell+fate.">Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate.</a> Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).</li><li>Manivannan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+profiling+unveils+dysregulation+of+cardiac+progenitor+cells+and+cardiomyocytes+in+a+mouse+model+of+maternal+hyperglycemia.">Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia.</a> Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).</li><li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data+with+structural+similarity.">Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity.</a> Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).</li><li>What is CellRanger. 10x Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger</a> (2023)</li><li>Hill, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+multi-omic+characterization+of+congenital+heart+disease.">Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease.</a> Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).</li><li>Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing:+In-depth+decoding+of+heart+biology+and+cardiovascular+diseases.">Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases.</a> Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).</li><li>Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+relief:+Emerging+methods+to+mitigate+dissociation-induced+artefacts.">Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts.</a> Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).</li><li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li><li>Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+effects+in+single-cell+RNA-sequencing+data+are+corrected+by+matching+mutual+nearest+neighbors.">Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMNN:+Batch+effect+correction+for+single-cell+RNA-seq+data+via+supervised+mutual+nearest+neighbor+detection.">SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection.</a> Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).</li><li>Stefanovic, S., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA-dependent+transcriptional+and+epigenetic+control+of+cardiac+lineage+specification+and+differentiation.">GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).</li><li>Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+proliferation,+and+growth+of+the+mammalian+heart.">Development, proliferation, and growth of the mammalian heart.</a> Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).</li><li>Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outflow+tract+formation-embryonic+origins+of+conotruncal+congenital+heart+disease.">Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).</li><li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data.">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).</li><li>Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+CUT&amp;RUN+method+for+regulation+network+reconstruction+of+low+abundance+transcription+factor.">An improved CUT&amp;RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor.</a> Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Gelişmekte olan kalbin hücresel bileşiminin kombine snRNA-seq ve snATAC-seq çalışmaları ile analizi, konjenital kalp hastalığının kökeni hakkında daha derin bir anlayış sağlar26. Birkaç araştırma laboratuvarı, kardiyak doku kriyoprezervasyonunun snRNA-seq27 üzerindeki etkilerini incelemiştir. İnsan hastalığının fare modellerinden taze mikro-disseke edilmiş doku kullanarak snRNA-seq ve snATAC-seq iletmek, farklı deneysel koşulları karşılaşt?...

Doğum kusurları arasında, konjenital kalp kusurları (KKH'ler) en yaygın olanıdır ve her yıl canlı doğumların yaklaşık% 1'inde görülür 1,2. Genetik mutasyonlar vakaların sadece küçük bir kısmında tanımlanmıştır, bu da gen regülasyonundaki anormallikler gibi diğer nedenlerin KKH 2,3'ün etiyolojisinde rol oynadığını ima etmektedir. Kardiyak gelişim, çeşitli ve etkileşimli hücre tiplerinin karmaşık bir sürecidir ve nedensel kodlamayan mutasyonların tanımlanmasını ve gen regülasyonu üzerindeki etkilerini zorlaştırır. Kalbin organogenezi, miyokardiyal, fibroblast, epikardial ve endokardiyal hücreler dahil olmak üzere farklı kalp hücreleri alt tiplerine yol açan hücresel progenitörlerle başlar 4,5. Tek hücreli genomik, kalp gelişimini incelemek ve hücresel heterojenitenin sağlık ve hastalık üzerindeki etkisini değerlendirmek için anahtar bir yöntem olarak ortaya çıkmaktadır6. Farklı parametrelerin eşzamanlı ölçümü için multi-omik yöntemlerin geliştirilmesi ve hesaplama boru hatlarının genişletilmesi, normal ve hastalıklı kalpte hücre tiplerinin ve alt tiplerinin keşfedilmesini kolaylaştırmıştır6. Bu makalede, fare embriyolarından elde edilen dondurulmuş kardiyak progenitör hücreler için aşağı akış snRNA-seq ve snATAC-seq (ayrıca snRNA-seq ve snATAC-seq kombinasyonu) ile uyumlu güvenilir bir tek çekirdekli izolasyon protokolü açıklanmaktadır7,8,9.
ATAC-seq, düzenleyici açık kromatin bölgelerinin tanımlanmasına ve nükleozomların10,11'in konumlandırılmasına izin veren sağlam bir yöntemdir. Bu bilgi, transkripsiyon faktörlerinin yeri, kimliği ve etkinliği hakkında sonuçlar çıkarmak için kullanılır. Bu nedenle, remodelleyiciler de dahil olmak üzere kromatin faktörlerinin aktivitesi ve RNA polimerazın transkripsiyonel aktivitesi, yöntem, kromatin yapısı 1,2'deki nicel değişiklikleri ölçmek için oldukça hassas olduğu için analiz edilebilir. Bu nedenle, ATAC-seq, belirli bir hücre tipinde transkripsiyonel düzenlemeyi kontrol eden mekanizmaları ortaya çıkarmak için sağlam ve tarafsız bir yaklaşım sağlar. ATAC-seq protokolleri, tek hücrelerde kromatin erişilebilirliğini ölçmek için de doğrulanmıştırve hücre popülasyonları 10,12,13 içindeki kromatin mimarisindeki değişkenliği ortaya koymaktadır.
Son yıllarda tek hücreler alanında kayda değer ilerlemeler olmasına rağmen, asıl zorluk bu deneyleri gerçekleştirmek için gereken taze örneklerin işlenmesidir14. Bu zorluğun üstesinden gelmek için dondurulmuş kalp dokusu veya hücre15,16 ile snRNA-seq ve snATAC-seq gibi analizlerin yapılması amacıyla çeşitli testler yapılmıştır.
Tek hücreli genomik verileri analiz etmek için çeşitli platformlar kullanılmıştır17. Tek hücreli gen ekspresyonu ve ATAC profillemesi için yaygın olarak kullanılan platformlar, çoklu mikroakışkan damlacık kapsüllemesi için platformlardır17. Bu platformlar mikroakışkan odalar kullandığından, enkaz veya agregalar sistemi tıkayabilir ve kullanılamaz verilere neden olabilir. Bu nedenle, tek hücreli çalışmaların başarısı, bireysel hücrelerin / çekirdeklerin doğru izolasyonuna bağlıdır.
Burada sunulan protokol, konjenital kalp kusurlarını anlamak için snRNA-seq ve snATAC-seq kullanan son çalışmalara benzer bir yaklaşım kullanmaktadır 18,19,20,21,22,23. Bu prosedür, taze mikrodiseke edilmiş kalp dokusunun enzimatik ayrışmasını ve ardından fare kardiyak progenitör hücrelerinin kriyoprezervasyonunu kullanır. Çözüldükten sonra, canlı hücreler saflaştırılır ve nükleer izolasyon için işlenir. Bu çalışmada, bu protokol, fare kardiyak progenitör hücrelerinin aynı nükleer preparatından snRNA-seq ve snATAC-seq verilerini elde etmek için başarıyla kullanılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>No catalog number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>59222C-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess III FL</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>No catalog number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin (5%)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>BN2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5x5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14190094</td>
			<td>Sterile and RNase-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Index Kit TT Set A 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI-FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milieu McCoy 5A&#160;</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16600082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000 S2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>No catalog number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PluriStrainer Mini 40&#181;m</td>
			<td>PluriSelect</td>
			<td>V-PM15-2021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-333-M005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Index Kit N Set A, 96 rxn</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 90mm Petri dish Sterilin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile double-distilled water</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R0582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride solution (HCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2194-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain (0.4%)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% - EDTA 1X</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide orifice filtered pipette tips 200 &#956;l</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>1152-965-008-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS SteREO Discovery.V8</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>No catalog number</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nuclei isolation from mouse cardiac progenitor cells for epigenome and gene expression profiling at single-cell resolution

Gelişmekte olan kalp, karmaşık düzenleyici mekanizmalar tarafından kontrol edilen çeşitli progenitör hücreleri içeren karmaşık bir yapıdır. Tek tek hücrelerin gen ekspresyonunun ve kromatin durumunun incelenmesi, hücre tipinin ve durumunun tanımlanmasını sağlar. Tek hücreli dizileme yaklaşımları, kardiyak progenitör hücre heterojenitesinin bir dizi önemli özelliğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle taze doku ile sınırlıdır, bu da farklı deneysel koşullara sahip çalışmaları sınırlar, çünkü taze dokunun teknik değişkenliği azaltmak için aynı anda işlenmesi gerekir. Bu nedenle, bu alanda tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNA-seq) ve yüksek verimli dizileme (snATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli test gibi yöntemlerden veri üretmek için kolay ve esnek prosedürlere ihtiyaç vardır. Burada, sonraki tek çekirdekli dual-omikler (kombine snRNA-seq ve snATAC-seq) için çekirdekleri hızlı bir şekilde izole etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, çekirdeklerin kardiyak progenitör hücrelerin dondurulmuş örneklerinden izole edilmesine izin verir ve mikroakışkan odalar kullanan platformlarla birleştirilebilir.

Among birth defects, congenital heart defects (CHDs) are the most common, occurring in about 1% of live births each year1,2. Genetic mutations are identified in only a minority of cases, implying that other causes, such as abnormalities in gene regulation, are involved in the etiology of CHD2,3. Cardiac development is a complex process of diverse and interacting cell types, making the identification of causal noncoding mutations and their effects on gene regulation challenging. Organogenesis of the heart begins with cellular progenitors that give rise to different subtypes of cardiac cells, including myocardial, fibroblast, epicardial, and endocardial cells4,5.&#160;Single-cell genomics is emerging as a key method for studying heart development and assessing the impact of cellular heterogeneity in health and disease6. The development of multi-omics methods for the simultaneous measurement of different parameters and the expansion of computational pipelines has facilitated the discovery of cell types and subtypes in the normal and diseased heart6. This article describes a reliable single-nucleus isolation protocol for frozen cardiac progenitor cells obtained from mouse embryos that is compatible with downstream snRNA-seq and snATAC-seq (as well as snRNA-seq and snATAC-seq combined)7,8,9.
ATAC-seq is a robust method that allows the identification of regulatory open chromatin regions and the positioning of nucleosomes10,11. This information is used to draw conclusions about the location, identity, and activity of transcription factors. The activity of chromatin factors, including remodelers, as well as the transcriptional activity of RNA polymerase, can, thus, be analyzed since the method is highly sensitive for measuring quantitative changes in chromatin structure1,2. Thus, ATAC-seq provides a robust and impartial approach to uncovering the mechanisms controlling transcriptional regulation in a specific cell type. ATAC-seq protocols have also been validated to measure chromatin accessibility in single cells, revealing variability in the chromatin architecture within cell populations10,12,13.
Although there have been notable advances in the field of single cells in recent years, the main difficulty is the processing of the fresh samples needed to perform these experiments14. To circumvent this difficulty, various tests have been carried out with the aim of conducting analyses such as snRNA-seq and snATAC-seq with frozen cardiac tissue or cells15,16.
Several platforms have been used to analyze single-cell genomics data17. The widely used platforms for single-cell gene expression and ATAC profiling are platforms for multiple microfluidic droplet encapsulation17. As these platforms use microfluidic chambers, debris or aggregates can clog the system, resulting in non-usable data. Thus, the success of single-cell studies depends on the accurate isolation of individual cells/nuclei.
The protocol presented here uses a similar approach to recent studies using snRNA-seq and snATAC-seq to understand congenital heart defects18,19,20,21,22,23. This procedure utilizes the enzymatic dissociation of freshly microdissected cardiac tissue followed by the cryopreservation of mouse cardiac progenitor cells. After thawing, the viable cells are purified and processed for nuclear isolation. In this work, this protocol was successfully used to obtain snRNA-seq and snATAC-seq data from the same nuclear preparation of mouse cardiac progenitor cells.

Yazar Spotlight: Tek Hücre Çözünürlüğünde Epigenom ve Gen İfadesi Profili Oluşturma için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu  

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

The main objective of this protocol is to study the interaction of genetic and environmental factors in the context of heart development and their contribution to congenital heart defects. Single nuclei approaches such as single nuclei RNA-seq and single nuclei ataxic are emerging as key methods to study cellular heterogeneity in health and disease during heart development. One limiting step of these experiments is that all the sample have to be run simultaneously.While working with all the experimental conditions, collecting fresh enough material is for all the condition simultaneously could be challenging. Although there have been a significant progress in the field in single cell for recent years, the main difficulty is processing free samples. Avoiding the difficulty is extremely benefit to identify the molecular mechanism underlying congenital heart disease defects.This protocol describes the steps to follow for successfully isolating high quality nuclei from frozen cardiac cell suspension obtained from mouse embryos. And our protocol is compatible with downstream single nuclei RNA-seq and single nuclei ataxic. We hope that this procedure will help interested researchers and encourage them to use this powerful method for their research.

Tek hücreli yaklaşımlar için tek hücreli süspansiyonların hazırlanmasına kıyasla, tek çekirdekli süspansiyonların hazırlanması çok daha zordur ve daha yüksek derecede çözünürlük ve işleme gerektirir. Başarılı kombine snRNA-seq ve snATAC-seq için anahtar faktör, temiz ve sağlam bir çekirdek süspansiyonudur. Etkili çekirdek izolasyonu protokolü, her doku tipine ve durumuna (taze veya dondurulmuş) uyarlanmalıdır. Burada, çekirdeklerin dondurulmuş fare embriyonik kalp hücrelerinden izol...

Watch this Scientific Journal Video about Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution at JoVE.com

Burada, hücre çekirdeği hazırlığını tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Kardiyak dokunun mikrodiseksiyonu ve enzimatik ayrışmasından sonra, progenitör hücreler donduruldu, ardından tek çekirdekli RNA dizilimi için kullanılan saf canlı hücrelerin izolasyonu ve yüksek verimli dizileme analizleri ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli tahlil yapıldı.

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

Bu protokolün temel amacı, genetik ve çevresel faktörlerin kalp gelişimi bağlamında etkileşimini ve konjenital kalp defektlerine katkılarını incelemektir. Tek çekirdekli RNA-seq ve tek çekirdekli ataksik gibi tek çekirdekli yaklaşımlar, kalp gelişimi sırasında sağlık ve hastalıkta hücresel heterojenliği incelemek için anahtar yöntemler olarak ortaya çıkmaktadır. Bu deneylerin sınırlayıcı bir adımı, tüm numunenin aynı anda çalıştırılması gerektiğidir.Tüm deneysel koşullarla çalışırken, yeterince taze malzeme toplamak aynı anda tüm koşullar için zor olabilir. Son yıllarda tek hücreli alanda önemli bir ilerleme olmasına rağmen, asıl zorluk serbest örneklerin işlenmesidir. Zorluktan kaçınmak, konjenital kalp hastalığı defektlerinin altında yatan moleküler mekanizmayı tanımlamak için son derece yararlıdır.Bu protokol, fare embriyolarından elde edilen dondurulmuş kalp hücresi süspansiyonundan yüksek kaliteli çekirdekleri başarılı bir şekilde izole etmek için izlenecek adımları açıklamaktadır. Protokolümüz, aşağı akış tek çekirdekli RNA-seq ve tek çekirdekli ataksik ile uyumludur. Bu prosedürün ilgilenen araştırmacılara yardımcı olacağını ve araştırmaları için bu güçlü yöntemi kullanmalarını teşvik edeceğini umuyoruz.

nuclei-isolation-from-mouse-cardiac-progenitor-cells-for-epigenome

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

1.4K Görüntüleme.  Aix-Marseille University. Bu protokolün temel amacı, genetik ve çevresel faktörlerin kalp gelişimi bağlamında etkileşimini ve konjenital kalp defektlerine katkılarını incelemektir. Tek çekirdekli RNA-seq ve tek çekirdekli ataksik gibi tek çekirdekli yaklaşımlar, kalp gelişimi sırasında sağlık ve hastalıkta hücresel heterojenliği incelemek için anahtar yöntemler olarak ortaya çıkmaktadır. Bu deneylerin sınırlayıcı bir adımı, tüm numunenin aynı anda çalıştırılması gerektiğidir...

Video: Yazar Spotlight: Tek Hücre Çözünürlüğünde Epigenom ve Gen İfadesi Profili Oluşturma için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu  

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene expression and chromatin state of individual cells allows the identification of the cell type and state. Single-cell sequencing approaches have revealed a number of important characteristics of cardiac progenitor cell heterogeneity. However, these methods are generally restricted to fresh tissue, which limits studies with diverse experimental conditions, as the fresh tissue must be processed at once in the same run to reduce the technical variability. Therefore, easy and flexible procedures to produce data from methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) are needed in this area. Here, we present a protocol to rapidly isolate nuclei for subsequent single-nuclei dual-omics (combined snRNA-seq and snATAC-seq). This method allows the isolation of nuclei from frozen samples of cardiac progenitor cells and can be combined with platforms that use microfluidic chambers.

Here, we present a protocol describing cell nuclei preparation. After microdissection and enzymatic dissociation of cardiac tissue into single cells, the progenitor cells were frozen, followed by isolation of pure viable cells, which were used for single-nucleus RNA sequencing and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing analyses.

Gelişim Biyolojisi

Mouse Cardiac Progenitor Cell Isolation, Digestion, and Freezing

Begin by placing the embryos dissected from the euthanized two to six-month-old pregnant female mouse in a cold complete medium with 1%fetal bovine serum. After removing the endometrial tissue, placenta, and yolk sack from the embryo under 5X magnification, dissect the cardiac progenitors from the embryonic heart region using forceps. Pull all the heart regions dissected from five mouse embryos in a 1.5 milliliter micro centrifuge tube and centrifuge them in a swinging bucket, pre-chilled to four degrees Celsius.Remove the supernatant, and wash the tissue with one milliliter of tissue culture grade PBS. Centrifuge the tubes at 300G for one minute at four degrees celsius. Then, remove the supernatant, and repeat two washes with one milliliter PBS.Once done, replace the PBS with 0.05%Trypsin-EDTA. Centrifuge and repeat two washes with 0.05%Trypsin-EDTA. To digest the tissue, add 50 microliters of 0.05%Trypsin-EDTA and heat for 10 minutes at 37 degrees Celsius.Next, apply a gentle mechanical dissociation after five minutes by aspirating the suspension up and down using a wide-orifice filter tip. Inactivate the Trypsin digestion activity by adding 350 microliters of complete medium to the dissociated cells. Pass the cell suspension through a 40 micrometer cell strainer.Prepare the cells for freezing by centrifuging the freshly-dissociated cell suspension. Carefully remove the supernatant and resuspend the pellet in one milliliter of chilled freezing medium. Transfer the cell suspension into a pre-cooled cryo vial, and place the cryo vial in a pre-cooled freezing container.Place the freezing container at minus 80 degrees Celsius for four to eight hours before transferring it to liquid nitrogen for sequencing experiments.

Fare Kardiyak Progenitör Hücre İzolasyonu, Sindirim ve Donma

Embryonic Heart Cell Thawing and Removal of Dead Cells

Begin by placing the frozen dissociated embryonic heart cell suspension containing cryo vials in a 37 degrees Celsius water bath for one to two minutes. Add one milliliter of complete medium, pre warmed at 37 degrees Celsius to the thawed suspension and mix it three times with a pipette. Then transfer the suspension to a 15 milliliter conical tube, containing 10 millimeters of warm complete medium.Pass the entire cell suspension over a 30 micrometer strainer and rinse the strainer with one to two milliliters of warm, complete medium. Collect the flow through in the same conical tube. Next, centrifuge the tubes at 300 G for five minutes.After removing the supernatant, wash the pellet with PBS and transfer the cell suspension into a 1.5 milliliter micro tube. Centrifuge the cell suspension and add 100 microliters of the provided magnetic microbeads to the pelleted cells. Homogenize the suspension five times using a wide boar pipette tip before 15 minutes of incubation at room temperature.In the meantime, rinse the magnetic separation column with 500 microliters of binding buffer. Once the incubation is complete, dilute the microbead cell suspension mixture using 500 microliters of binding buffer. Next, add 0.6 milliliters of the cell suspension to the magnetic separation column.Collect the live cell effluent in a 15 milliliter centrifuge tube. Next, rinse the 1.5 milliliter micro tube that contained the cell suspension using one milliliter of binding buffer. After rinsing, transfer the binding buffer from the 1.5 milliliter micro tube to the column and collect the effluent in the same 15 milliliter tube.Repeat the rinsing of the 1.5 milliliter tube using one milliliter of binding buffer. After centrifuging the effluent at 300 G for five minutes, remove the supernatant without disrupting the cell pellet. Add one milliliter of the PBS BSA solution and gently mix by pipetting using a wide orifice pipette tip.Then transfer the cell suspension into a 1.5 milliliter micro tube. Again, centrifuge the cell suspension and remove the supernatant without disrupting the cell pellet. Repeat the two washes of one milliliter of PBS BSA.After removing the one milliliter of PBS BSA, resuspend the cells in 100 microliters of PBS BSA solution. Mix it by pipetting 10 times. Determine the concentration by performing a trypan blue assay to ensure a cell count of more than or equal to 100, 000 cells and perform a fluorescence based assessment for the viability of the cells.The additional step of sorting and removing the dead cells after thawing allowed the procurement of a cleaner cell suspension with significantly higher cell viability and improved the quality of the starting sample. For more accuracy, two different counting methods were used to quantify the cells and nuclei, including trypan blue and the fluorescence based assessment of the viability. In this protocol, it was observed that the cell viability passed from 80 to 90%before nuclei isolation to less than 5%after nuclei isolation.

Embriyonik Kalp Hücresi Çözülmesi ve Ölü Hücrelerin Uzaklaştırılması

Nuclei Isolation from Cardiac Progenitor Cells

To begin, clean the working place and materials with 70%ethanol and RNase removing solution. Freshly prepare lysis buffer, lysis dilution buffer, 0.1 x lysis buffer, and wash buffer and maintain the buffers on ice. Pre-chill swinging bucket centrifuges to four degrees Celsius.Centrifuge the cardiac progenitor cell suspension in a swinging bucket centrifuge. Gently remove all the supernatant without touching the bottom of the tube. Add 100 microliters of chilled 0.1 x lysis buffer to the cell suspension, and mix it by pipetting 10 times.After five minutes of incubation on ice, add one milliliter of chilled wash buffer and mix it. After centrifuging the suspension, remove the supernatant and repeat two more washes with chilled wash buffer. Prepare the diluted nuclei buffer.After resuspending the nuclei in the nuclei buffer, place the nuclei stock solution on ice. When the quality of the isolated nuclei was assessed by the evaluation of the nuclear membrane morphology, the isolated nuclei appeared smooth and uniformly round under Bright-field microscopy indicating an effective isolation process.