Biz izole edebilir ve hem mercan sağlığını teşvik edebilir ve aynı zamanda kirlilik etkisini azaltmak ve değişen dünyada bir resif sebat katkıda bulunabilir probiyotikler monte. Tanımlanan izolasyon ve tarama yaklaşımı, kirleticilerin bozulması veya mercanlar gibi deniz organizmaları için diğer yararlı özellikler gibi önemli metabolik aktiviteler sunan mikroorganizmaları seçmek için kullanılabilir. Bu yöntem herhangi bir kirletici maddeyi bozabilecek mikroorganizmaları izole etmek için uygulanabilir.
Ve ayrıca, diğer malzeme kaynakları bitkiler, toprak, su, herhangi bir şey gibi diğer çevresel örneklerde kullanılabilir. Literatürü incele ve amacınız için iyi adaylar olabilecek suşlara odaklanmaya çalışın. Mümkünse, bu suşlar için izolasyon yöntemleri doğrudan ve bilinen patojenler kaçının.
Ve eğer bir bakteri konsorsiyumu kullanmayı hedefliyorsanız, konsorsiyum üyelerinin birbirlerine karşı düşmanca bir faaliyete sahip olup olmadığını araştırmak da çok önemlidir. Mercanlar giderek artan yok olma riski altında olduğundan, bu metodoloji dünya çapında uygulanmaya başlanıyor ve bu yöntemin yayılması ve standartlaştırılması gerekiyor. Bazı mercan araştırmacıları geleneksel mikrobiyoloji konusunda hiçbir deneyime sahip olduğundan, bu yüzden sık sık bu tür bir yaklaşım ile devam etmek için nasıl tavsiye isteyen edilmiştir.
Başlamak için, her hedefli örnekleme sitesinden, üç aylık su 500 mililitre toplamak için vida kapakları ile steril şişe kullanın. Numune işleme daha sonra oluyorsa, şişeleri dört santigrat derecede tutun. Su örneklerinin aynı örnekleme alanından mercan parçalarını kesmek için steril bir çift pliers ve forceps kullanın.
Deniz suyunun gevşek bağlanmış serbest yaşayan bakterilerinden kurtulmak için 20 mililitre steril tuzlu çözelti veya yapay deniz suyu kullanarak numune mercan parçasını durulayın. Forseps kullanarak, steril tuzlu çözelti içeren bir vida kapağı ile steril bir kap içine her mercan parçası yerleştirin. Steril çökezleyiciler ve pliers kullanarak, bir tartım ölçeğinde steril Petri kapları mercan parçaları beş gram ağırlığında.
Beş gram mercan örneğini steril bir harça aktarın ve steril bir havaneli kullanarak yerleştirin. Steril bir spatula kullanarak, serpiştirilen numuneyi 25 mililitre %3 sodyum klorür steril çözeltisi ve 2,5 milimetrelik 10 ila 15 cam boncuk içeren steril bir kültür şişesine aktarın. Macerate maksimum miktarda kurtarmak için tüp içine harç yıkamak için 20 mililitre steril tuzlu çözelti kullanın.
Mikroorganizmaları farklı mercan bölmelerinden ayırmak için şişeleri örnekleme alanının su sıcaklığında 16 saat boyunca 150 kez g'de sabit ajitasyon altında tutun. Bakterileri seçmek için, ilk olarak mercan örnekleri için steril tuzlu çözeltide 10 ila 10 ila 10 ila 10 ila su numuneleri için negatif altı arasında seri seyreltme gerçekleştirin. Pipet ucu atmadan önce beş kez yukarı ve aşağı seyreltme.
O zaman her birini girdap. Bir sonraki seri seyreltme gerçekleştirmeden önce her seferinde beş saniye boyunca numuneleri girdaplayın. Pipet 100 mikrolitre petri kaplarda her seyreltme% 3 sodyum klorür lysogeny suyu agar orta ve plaka içeren.
Plakaları hedef sıcaklıkta bir ila üç gün kuluçkaya yatırın, örneğin 26 santigrat derece. Günde bir kez tabakları kontrol edin. Çizgi plaka tekniğini kullanarak yeni plakalarda farklı büyüme morfolojileri sunan kolonileri seçin ve izole edin.
Plakalarda büyüyen saf koloniler için bu adımı gerektiği kadar tekrarlayın. Dört derece santigrat veya gliserol olarak el yazması açıklandığı gibi izole saklayın. EE2 bozunma yeteneği testi gerçekleştirmek için, taze plakalardan tek bir koloni seçin ve bir tüpiçinde iki mililitre steril LB ortamı aşılayın.
Bir gliserol stok durumda, GLIserol bakteriyel stok 10 mikrolitre almak ve LB agar plakaları üzerine çizgi. Bir gecede 24 ila 28 santigrat derecede kuluçkaya yat. LB orta içeren tüpü bir gecede 24 ila 28 santigrat derecede 150 kez g'de sürekli ajitasyon altında yerleştirin.
Bakteri üremesonra, oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 8,000 kez g onları santrifüj ederek hücreleri pelet. Supernatant atın. Kalan LB suyu yıkamak için, hücreleri yeniden askıya almak için tuzlu su iki mililitre ekleyin.
Karbon kaynağı nın izine rastlanmamalarını garanti etmek için yıkamayı iki kez tekrarlayın. Tek karbon kaynağı olarak EE2 içeren minimum Bushnell Haas kültür ortamında yıkanmış ve yeniden askıya alınan hücreleri aşıla. 16 ila 72 saatlik kuluçka dan sonra 600 nanometrede optik yoğunluk ve LB agar ortamındaki koloni şekillendirme birimlerimizle bakteri büyümesini değerlendirin.
Tek karbon kaynağı olarak yağ-su çözünür fraksiyonu ve yağ-su çözünmez fraksiyonu içeren minimum ortam hazırlamak için, alt tabakada bir vana içeren bir filtre şişesinde 500 mililitre steril distile suya %1-2 ham petrol ekleyin. 48 saat boyunca 150 kez g 24 ila 28 santigrat derece sürekli ajitasyon altında şişe tutun. Bundan sonra, şişeyi kararlı bir yüzeye yerleştirin ve çözünür ve çözünmez kesirin ayrılmasıiçin 10 ila 20 dakika bekleyin.
Daha sonra yağ-su çözünür fraksiyonu yağ-su çözünmez fraksiyonu tasarruf yeni bir steril şişe aktarmak için alt filtre şişesi açın. Sonra Bushnell Haas agar minimum orta iki şişe hazırlamak. Otoklavla.
Agar orta 500 mililitre yapmak için tek karbon kaynağı olarak yağ-su çözünür fraksiyonu ile birleştirin. Aynı şeyi yağ-su çözünmez fraksiyonu ile yapın ve her ortamın yaklaşık 25 mililitresini petri kaplarına aktarın. Yağ aşağılayıcı bakterileri izole etmek için, daha önce seyreltilmiş numuneleri ve pipet100 mikrolitre her seyreltme yi agar ortamı içeren Petri kaplarına yeniden kullanın ve bunları tablayın.
Plakalarınız için negatif kontroller tutmayı unutmayın. Bulaşıkları hedef sıcaklıkta bir ila üç gün kuluçkaya yatırın ve izolasyon prosedürlerini daha önce olduğu gibi tekrarlayın. Bu protokolde mikroorganizmalar farklı su kaynaklarından ve mercan nubbinlerinden izole edilmiş ve putatif BMC özellikleri sunmuş ve farklı kirletici sınıflarını bozabilme yeteneğine sahiptir.
Rio de Janeiro Federal Üniversitesi Çevre Sanitasyon Deneysel Merkezi'nden alınan bir kanalizasyon arıtma tesisinde toplanan su örnekleri kullanılarak, EE2'yi bozabilen 33 bakteri suşizole edildi. Ayrıca, yağ aşağılayıcı bakterileri seçme tekniği kullanılarak, hem yağ-suda çözünen fraksiyonu hem de yağ-su çözünmez fraksiyonu bozabilir 20 suş izole edildi. Putatif BMC karakteristikleri mikroorganizmalarda taranmış, aralarında mercan patojeni Vibrio kolera litikusa karşı güçlü antagonistik aktivite sunan bir suş, iyi bir katalaz üreticisi olan üreyi bozabilen suşlar ve potansiyel olarak yararlı genler sunan mikroorganizmalar bulunmuştur.
Hem biyoremediasyon hem de BMC aşılamasını kullanan mercanları yağa maruz kalma etkilerinden tahmin etmek mümkün oldu. Mercandan izole edilmiş bir petrol biyoomediator PBMC konsorsiyumu% 1 yağmaruz mercan nubbins aşılanmış oldu. Mercan sağlığına kıyasla daha iyi korunmuş bir fotokimyasal yetenek gösterdi.
Örnekleri oda sıcaklığında çok uzun süre bırakmayın. Aksi takdirde, mikrobiyal topluluk değişebilir ve hastalıkla ilgili mikroplar diğerleri aşırı büyüyebilir. Ham petrol zehirlidir.
Lütfen bu veya kullanmaya karar başka bir kirletici ile çalışırken uygun kişisel koruyucu ekipman kullandığınızdan emin olun. Bu teknik mercan restorasyonu alanında yenilikçi bir yol açtı ve okyanus biyoremedimi potansiyel olarak küresel değişimin neden olduğu ekonomik, ekolojik ve sosyal etkileri en aza indirmek için kullanılabilir.
