Kırılgan zebra balığı embriyolarının sınırsız büyümesine olanak tanıyan ve aynı zamanda onları tamamen sabit bir konumda tutan hızlandırılmış görüntüleme için bir montaj yöntemi geliştirdik. Bu montaj yöntemi hızlı, kolay ve ucuzdur ve herhangi bir ters mikroskop üzerinde laboratuvar görüntüleme için çalışır. Bu yöntemi canlı zebra balığı embriyolarının görüntülemesi için geliştirdik, ancak diğer küçük su hayvanı modellerinin görüntülenmesi için değiştirilebilir.
Yetişkin zebra balıklarını yetiştirerek başlayın. Öğleden sonra, bir-iki erkek-kadın oranı ile üreme tankları içine balık yerleştirin. Sonra embriyo ortamda% 1 düşük erime agarose bir stok çözüm hazırlamak ve bir mikrodalga fırında ısıtarak eritin.
Aliquot 1.5 mililitre tüpler içine agarose çözeltisi. Distile suda %4'lük triain bir stok çözeltisi yapın ve agarose ve tricaine'i dört santigrat derecede saklayın. Tricaine toksik tir ve tartılması ve duman kaputunda hazırlanması gerekir.
Çiftlaştıktan sonra, E3'teki zebra balığı embriyolarını petri kabında hasat edin ve montajdan önce yaklaşık 28 saat boyunca 26,5 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Embriyoları %0.02 tricaine ile anestezi altına alayın ve embriyoyu serbest bırakmak için chorion'u yavaşça sürükleyerek ve çekerek mikroskop altında dekorionate. Montajdan hemen önce, agarose çözeltisini 65 santigrat dereceye ısıtın ve embriyonun ısıdan zarar görmemesi için yaklaşık 30 santigrat dereceye soğumasını bekleyin ve agarose çözeltisine tricaine ekleyin.
Bir numara sıfır coverglass alt ile 35 milimetre cam alt yemekleri kullanın. Yavaşça bir cam pipet veya mikropipet ile çanak altına doğru onun yanal yanlarından biri ile dechorionated embriyo yerleştirin, sonra dikkatle bir micropipeette ile kalan E3 çıkarın. Embriyoyu kapsayacak şekilde yemeğin altına bağlı kapak camı tarafından oluşturulan küçük kuyuya ilk agarose çözeltisini ekleyin ve agarose'un küçük kuyuyu kapladığından emin olun ama taşmaz.
İki coverglasses arasında embriyo ile dar bir agarose dolu alan oluşturmak için bir coverglass ile küçük kuyu kapağı. Örtü camının alt kısmındaki kapak camının üzerine %1'lik agarose çözeltisi yerleştirin ve bu tabaka, kapak camı sağlamlaştırdıkça yerinde tutacaktır. Daha sonra sistemin sulu tutmak için% 0.02 tricaine içeren E3 ile çanak kalan kısmını doldurun.
Katman bir için optimal agarose konsantrasyonunu belirlemek için, agarose artan konsantrasyonlarda embriyomonte ve embriyo bozulma ve hareketlilik en aza indiren konsantrasyonu belirlemek için zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek, sonra sonuçlara dayalı konsantrasyonları daha ince bir dizi test. Bu protokolün en kritik adımı birinci katman için agarose'un en uygun konsantrasyonu belirlemektir. Agarose'un %0.030 0.032 gibi farklı nano konsantrasyonlarını test edin.
en uygun konsantrasyonu bulmak için. Embriyoların hızlandırılmış görüntülemesini gerçekleştirmek için, 28,5 santigrat dereceye ayarlanmış bir kuvözve 55 saate kadar görüntü içeren bir mikroskop aşaması kullanın. Aynı anda birkaç embriyo görüntü için, birkaç yemekleri tutan bir sahne adaptörü kullanın ve embriyolar yatay konumlandırılmış böylece tek tek yemekleri döndürmek.
Düşük büyütme hedefi seçin, sonra göz parçasını kullanarak embriyoları bulmak ve nihayet yemekleri döndürerek yatay olarak hizalayın. Embriyoların konumunu yazılıma kaydedin ve verileri otomatik olarak kaydetmek için bir dosya adı oluşturun. İğne deliği boyutunu, tarayıp hızını, görüntü boyutunu ve yakınlaştırmayı ayarlayın.
Ardından, görüntülenecek görüntüleri ve floresan kanalları yakalamak için daha yüksek bir büyütme seçin. Her kanal için lazer gücünü ve dedektör yüksek voltajı ayarlayarak doygunluğu önlerken ve fotoğraf beyazlatmasını sınırlandırırken mümkün olan en iyi dinamik aralığı topladığından emin olun. Daha sonra, 10X hedefi ile tüm embriyo görüntü, görüntüleme çeşitli alanları görüntü lemek ve bu büyük görüntü alanı içinde uygun olduğundan emin olmak için embriyo konumunu ayarlayarak onları bir araya dikiş yazılımdaki büyük görüntü yakalama ayarlarını ayarlayın.
Z-yığınlarını yakalama ayarlarını el yazması yönergelere göre yapılandırın. Uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme sırasında birden fazla embriyonun odak noktasını korumak için, otomatik bir odak kullanın ve her embriyo için ayrı ofset düzeylerini referans düzlemine odaklanacak şekilde ayarlayın. Ardından, mikroskop yazılımındaki hızlandırılmış parametreleri bir saatlik aralıklarla 55 saat süreyle görüntüye ayarlayın.
Her döngüde, iki embriyo veri kümesini sırayla yakalayın ve verileri otomatik olarak kaydedin. Görüntüleri işlemek için mikroskop yazılımını kullanın. Birden fazla embriyo görüntülenmişse, görüntülemenin konumuna göre veri kümelerini bölerek her embriyo için bağımsız dosyalar oluşturun.
Maksimum yoğunluk projeksiyonları veya benzer bir aracı kullanarak 3B zaman veri kümelerini 2B zaman veri kümelerine dönüştürün. Son olarak, AVI olarak kaydederek ve saniyede beş kare oynatma hızı için 200 milisaniye aralıklarla sıkıştırma seçeneğini seçerek film dosyaları oluşturun. Bu katmanlı montaj yöntemi, zebra balığı embriyolarının büyümesine izin verirken aynı zamanda hareketlerini kısıtlamayı mümkün kılar.
Agarose konsantrasyonu çok yüksekse, embriyolar bozulur. Ama çok düşükse, hızlandırılmış mikroskopi sırasında görüş alanının dışına çıkarlar. Optimal agarose konsantrasyonunun 0.028 ile 0.034% arasında olduğu saptandı Canlı transgenik zebrabalığı tüm embriyo ve GFP tüm embriyo ve GFP ifade vaskülatür endotel hücrelerinde 55 saat boyunca intersegemental damar filizlendi, subintestinal ve baş vaskülatür gelişmiş ve gövde uzantısı ile kaudal ven pleksus yoğuşma oluştu.
GFP ve motor nöronları ifade eden embriyolar motor nöron gelişimini görselleştirmek için görüntülendi. Motor nöron aksonları embriyonun ventral tarafına doğru somitler üzerinde ventral nöral tüp filiz. Motor nöron aksonların intersegmental damarların konumuna göre dorsal filizlenmesinin birlikte gelişimi daha yüksek bir büyütme kullanılarak görüntülendi.
Bu mümkün ventral akson filizlenen ince ayrıntıları yanı sıra nöral tüpten filizlenen dorsal akson görselleştirmek için yaptı. Somit sayıları arttıkça, somitler de uzunluk ve genişlik uzamıştır. Bu süreç kaslarda GFP ifade transgenik embriyolar kullanılarak görüntülendi.
Agarose'un optimum konsantrasyonu çok dar olduğundan, agarose çözeltisinin stok çözeltisini hazırlarken ölçümlerdeki küçük farklılıklara karşı çok hassastır ve her yeni agarose çözeltisi için yeniden tanımlanması gerekir. Uzun süreli zaman atlamalı görüntüleme sırasında fotoğraf toksisitesi ve fotoğraf beyazlatma olasılığını azaltmak ve deneyler arasında tutarlılık sağlamak için görüntü boyutu ve çözünürlüğü, taramalar hızı, yakınlaştırma, dedektör yüksek voltaj ve lazer gücü gibi görüntüleme parametrelerini dikkatle ayarlamak önemlidir. Transgenik zebra balığı embriyoları için bu montaj yöntemini kullanarak tüm organizmanın uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesini takip ederek, farklı dokuların birlikte nasıl geliştiğini görselleştirebiliriz.
