Name: induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos
Uploaded: 2017-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos at JoVE.com

Bu çalışma Wellcome Trust SIA Ödülü 100329 / Z / 12 / Z&#39;den WAH&#39;ya ve DFG bursu KH 376 / 1-1&#39;e Destek ile desteklendi.

Bu protokol, Cambridge Üniversitesi hayvan bakım kılavuzlarına uygundur. 1. Hayvan Bakımı <ol><li> Kurbağa embriyoları NOT: Embriyolar hayvan ve laboratuar tesislerine göre yükseltilebilir ve bakımı yapılabilir. Burada, hayvan bakımı örneği açıklanmaktadır. <ol><li> 0.88 mM NaCl, 10 uM KCI, 24 uM NaHC03, 100 uM HEPES, 8.2 uM MgS04, 3.3 uM Ca (NO3) 2 ve 4.1 uM CaCl2, pH 7.6&#39;dan oluşan 0.1x Modifiye Barth&#39;s Solution (MBS) çözeltisini hazırlayın. . </li><li> Xenopus laevis embriyolarını in vitro fertilizasyon yoluyla elde edin. <ol><li> Yetişkin dişi Afrika pençe kurbağalarında ( Xenopus laevis) yumurta dökmeden önce bir hafta (60 IU) gonadotropin ve 12 saat (500 IU) gonadotropik gonadotropin enjeksiyonu ile yumurtlamaya neden olun. </li><li> Oositleri toplayın ve homojenize edilmiş erkek testis ile in vitro döllerler. </li><li> Rai16 - 18 ° C&#39;de 0.1x MBS&#39;de embriyolar yapın. Xenopus laevis&#39;in Normal tablosuna göre embriyoları sahneleyin 14 . Deney için canlı ve canlı tüm embriyolar seçerken dikkatli olun. </li></ol></li></ol></li><li> Zebra balığı embriyoları NOT: Embriyolar hayvan ve laboratuar tesislerine göre yükseltilebilir ve bakımı yapılabilir. Burada, hayvan bakımı örneği açıklanmaktadır. <ol><li> Embriyo ortamı hazırlayın: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgS04 ve% 0.00001 metilen mavisi. </li><li> 26.5 ° C&#39;de WT AB suşu Danio rerio&#39;nun muhafaza edilmesi ve yetiştirilmesi. </li><li> Dölleme sabahı embriyonları toplayın, döllenmeden 4 gün sonra (28 ° C) yukarıdaki gibi hazırlanan embriyo ortamında yükseltin, daha önce tarif edildiği gibi 15&#39;i seçin . </li></ol></li></ol> 2. İnvivo Hipoksinin İndüklenmesi </p&gt; <ol><li> Gaz inkübasyon odasının inşası <ol><li> Normal olarak balık tesislerinde hipoksik oda yapımı için kullanılan su ıslahı tankını kullanın ( Şekil 1A ). Bu depo 24 delikli bir plakaya uymalıdır. </li><li> Şekil 1&#39;de tasvir edildiği gibi, örgülü 24 gözlü bir plaka hazırlayın. Bu amaç için bir frezeleme makinesi kullanarak, 24 delikli plakanın plastik tabanını ( Şekil 1B ) çıkarın. </li><li> Kuyuların plakaları ile plakanın duvarları arasındaki boşluğu epoksi reçine ile doldurun. Reçine ile kaplanmış plastik üzerine 0,1-0,2 mm&#39;lik bir ağ çapı olan herhangi bir naylon filtreyi ( Şekil 1C ) takın ve plakanın tamamen kurumasına izin verin. </li><li> Kuruduktan sonra, reçine ve ağla kaplı plaka duvarlarına 10 mm uzunluğunda ve 5 mm çaplı üç veya dört tünel açın ( Şekil 1D ). Plastik veya Teflon çubukları takın( Şekil 1E ) uygun tüplere ve 30 mm uzunluğa yerleştirin ve plakayı tercih edilen tanka yerleştirin. </li><li> Ağ altı 24 oyuklu plakayı seçilecek su makinesine yerleştirin. Silikon boru kullanarak ( Şekil 1F ) uygun bir gaz regülatörü (I) (BOC 200) kullanarak bir distribütör valfine ( Şekil İH ) istenen O 2 / N 2 karışımı veya başka bir gaz karışımı ile bir gaz tankı ( Şekil 1G ) takın bar). Burada, burada sunulan hipoksi deneylerinde% 5 oksijen ve% 95 N 2 karışımını içeren gaz tanklarını kullanın. </li><li> Oda ortamındaki oksijen akış oranını saniyede 0.0017-0.0019 metreküpye ayarlayın. Bu gaz akış hızı altında, levhanın oyuklarında ortamın herhangi bir rahatsızlığı görülmemelidir. <ol><li> Bu amaç için yüksek saflıkta iki kademeli gaz regülatörünü kullanın. Regülatörü, hava basıncını düşürmek için ayarlayın.E gaz tankına (1000-2500 PSI), deney boyunca 10 PSI&#39;lik bir besleme basıncına getirin. Bu nedenle, bu gaz regülatörünün spesifikasyonlarına uygun olarak, deney boyunca saniye başına 0.00189 m3&#39;lük bir akış hızı elde edilmiştir. </li></ol></li><li> Silikon boru ve dağıtıcı valfi, su deposu içindeki bir seramik disk difüzörüne ( Şekil 1J ) bağlayın. Sulu tankı kapatın ve silikon yağı ile kaplayarak ( Şekil 1K ) kapağı dikkatlice kapatın ( Şekil 1 ile karşılaştırın). Belli bir oda sıcaklığının olmaması durumunda, hipoksik bölmeyi gereken sıcaklıktaki bir laboratuvar inkübatörüne yerleştirin. </li><li> Deneyde kullanılan embriyoların türüne bağlı olarak, uygun embriyo ortamı ile hipoksik bölme deposunu doldurun ve gaz karışımını seramik disk difüzöründen difüze etmeye başlayın. 10-15 dakika dengelenir. </li><li> Dengeleme yapıldıktan sonraİstenen oksijen karışımını, bir oksimetre veya oksijen sondası kullanarak sudaki oksijen konsantrasyonunu ölçün. Burada, bu amaçla fiber optik çözünmüş oksijen ve sıcaklık sensörü ile bir oksimetre kullanın. </li></ol></li><li> Embriyolarda hipoksi oluşumu <ol><li> Deney için embriyoları dikkatli bir şekilde seçin, hipoksi inkübasyonu için canlı ve canlı tüm embriyolar kullanın. Burada, burada sahnenin 38 veya zebra balığı embriyolarının kurbağa embriyolarının 4 dpf deneyleri sunuldu. </li><li> Embriyonik yemekleri gaz inkübasyon odası içeren inkübatöre ( Şekil 1K ) yerleştirin ve inkübatör sıcaklığına kadar dengeye getirmelerine izin verin. </li><li> Embriyoları, plastik bir pipet kullanarak, gaz inkübasyon odasının örgülü 24 delikli plakanın ( Şekil 1B ) oyuklarına dikkatle aktarın. Protokoldeki embriyo transferi için daima bir plastik pipet kullanın. NOT: Bu plakanın her kuyusu,Evre 38&#39;in 5 kurbağa embriyosuna veya 4 dpf&#39;ye kadar 7 zebra balığı embriyosuna. Farklı genotipler kullanıyorsanız, kuyuları dikkatle etiketleyin. </li><li> Gaz inkübasyon odasını, seçilen gaz karışımı ile 5 saat süreyle veya deneye uyan daha uzun bir süreyle sabit bir infüzyon altında tutun. Burada% 5 O 2 ve% 95 N 2 karışımını kullanın. </li><li> Embriyonları gaz inkübasyon odasından özenle embriyo tipine uygun normoksik ortama aktarın ve hemen Adım 3 veya 4&#39;e geçin. </li><li> Daha normoksik bir tedavi gerekiyorsa, embriyoları embriyo tipine uygun normoksik ortama dikkatlice aktarın. </li></ol></li></ol> 3. HIF-1α Düzeylerini İzleyerek Başarılı Hipoksi İndüksiyonunun Kontrolü <ol><li> hazırlıklar <ol><li> 0.1x MBS&#39;de 0.4 mg / mL MS222 solüsyonu hazırlayın. </li><li> Homojenleştirme tamponunu hazırlayın: Radyoimmünopresipitasyon Testi tamponu (RIPA bUffer) ekleyin ve Proteaz İnhibitörü ile deneyiniz için gerekli tampon miktarını 1: 100 v / v nihai bir konsantrasyonda tamamlayın. </li><li> Western blot için çözümler hazırlayın. <ol><li> 4x Laemmli jel yükleme tamponu hazırlayın: 425 mM Tris pH 8.0,% 40 v / v Gliserol,% 8 v / v SDS,% 4 v / v beta-merkaptoetanol,% 0.5 a / a Bromofenol Mavi, 10 mL toplam hacim ddH2 O. </li><li> 5x koşu tamponu hazırlayın: 15 g Trizma baz, 72 g Glisin, 5 g SDS, 1 L toplam hacim ddH20. </li><li> Transferi tamponunu hazırlayın: 2.66 g Trizma baz, 14.4 g glisin, 200 mL% 100 metanol, 1 L toplam hacim ddH20. </li><li> 10x TBST hazırlayın: 5 mL 1 M Tris pH 8.0, 30 mL 5M NaCl, 2.5 mL Tween 20, 1 L toplam hacim H20. </li><li> Engelleme çözeltisi hazırlayın: 1% TBST içinde yağsız süt tozu ile% 4 w / v. </li></ol></li></ol></li><li> Doku toplanması <ol><li> 0.4 mg / mL MS222 solüsyonu ile banyo yapılarak embriyoları anestezi edin16 , 17 ve plastik bir pipet kullanarak homojenleştirme tamponu ile doldurulmuş bir plastik reaksiyon tüpüne aktarın. Embriyo başına 20 mcL tampon kullanın. HIF1α protein seviyelerinde önemli bir değişiklik belirlemek için, 4 dpf safha 38 veya 7 zebra balığı embriyolarının en az 5 kurbağası embriyosuna ihtiyaç duyulduğunu unutmayın. </li><li> Dokuyu uygun bir doku homojenleştirici veya sonikatör kullanarak homojenize edin. Enkayı santrifüjle (15 dakika; 13.000 xg; 4 ° C) çıkarın. <ol><li> Alternatif olarak, anestezi edilmiş kurbağa embriyolarından 17 retinaları ayırın ve yukarıdaki gibi homojenleştirin. 10 retinada 20 μL homojenleştirme tamponu kullanın. </li></ol></li><li> Bir pipet kullanarak süpernatantı alın, 85 ° C&#39;de 5 dakika denatürasyon yapın ve 1x v / v&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar Laemmli jel yükleme tamponu ile takviye edin ( örn. , 15 uL homojenata 4x Laemmli tamponu 5 uL ekleyin.). Bu süpernatanı Wes için kullanınÖrnekler -20 ° C&#39;de lekelenir veya dondurulur. </li></ol></li><li> Western Blot <ol><li> Adım 3.2&#39;de açıklandığı gibi hazırlanan numuneleri 1x v / v Koşu tamponu kullanarak bir elektroforez sisteminde prekast 12% jel üzerine yükleyin. Protein ebadı tayini için bir protein merdiveni kullanın. Proteinleri, üreticinin protokolüne göre buz üzerinde 4 ° C&#39;de paketlenmiş 1 saat süreyle transfer tamponu içinde bir nitroselüloz zara (0.45 um membran) aktarın. </li><li> Membranı engelleme tamponunda 60 dakika inkübe eden spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin. 1x TBST içinde 3 x 10 dakika yıkama ile izleyin. </li><li> Membranı, RT&#39;de 2.5 saat seyreltik tavşan anti-HIF-1α antikoru ve fare anti-α-tubulin solüsyonlarına sırasıyla 1: 100 v / v ve 1: 5000 v / v damıtana kadar inkübe edin. 1x TBST içinde 3 x 10 dakika yıkama ile izleyin. </li><li> Algılama için, keçi anti-tavşan ve keçi anti-fare HRP-konjüge antikorlarda, 1 saat boyunca 1: 1000 v / v seyreltilmiş Blocking çözeltisi içerisinde inkübe edin.1x TBST&#39;de 3 x 10 dakika yıkama yapın ve ticari bir kit ve seçilen bir geliştirici makine kullanarak HRP boyasını görselleştirin. </li><li> Dijital niceleme kullanarak HIF1α protein miktarını ölçün. </li></ol></li></ol> 4. Hipokside Hücre çoğalmasının izlenmesi <ol><li> hazırlıklar <ol><li> Seçilen embriyo ortamında 5 mM EDU solüsyonu hazırlayın. Solüsyon derhal veya bölünebilir ve -20 ° C&#39;de 6 aya kadar depolanabilir. </li><li> Fosfat Tamponlu Salin (PBS) hazırlayın veya ticari kaynaklardan PBS satın alın. 115 ° C&#39;de 10 dakika süreyle otoklavda tutun. </li><li> EdU birleşmesinin saptanması için çözümler hazırlayın. <ol><li> Sabitleme çözeltisi hazırlayın: PBS içinde% 4&#39;lük v / v&#39;lik% 16&#39;lık Formaldehit stok solüsyonu hazırlayın. </li><li> Sakaroz çözeltisi hazırlayın: PBS içinde% 30 w / v sükroz. </li><li> PBST&#39;yi hazırlayın: PBS içinde% 0.1 v / v Triton X-100. </li><li> Engelleme solüsyonu hazırlayın:% 10 v / v Isıyla inaktive Keçi Serumu (HIGS) PBST&#39;de. </li><li> PBST içinde DAPI çözeltisi hazırlayın: 1: 1000 v / v 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). </li></ol></li></ol></li><li> Embriyoların, EdU birleşmesi için hipokside inkübe edilmesi <ol><li> % 1 v / v DMSO ile takviye edilmiş 400-500 mL 5 mM Edu solüsyonu ile gaz inkübasyon odasını doldurun. Çözeltiyi deneyden önce kullanılan 15 dakika boyunca aynı gaz karışımı ile önceden dengeleyin. Kuluçka çözeltisinin hacminin kısa çubukları ( Şekil 1E ) örgü alt plakaya tutturarak en aza indirebileceğini unutmayın. </li><li> Gaz borusunu,% 5 O 2 ve% 95 N 2 gaz karışımı içeren gaz silindirine bağlayın. Çözeltiyi 15 dakika inkübe edin. </li><li> Embriyoları hipoksik bölmeye aktarın, bunları eşit olarak kuyular arasında dağıtın ve 2 saat inkübe edin. Her kuyu 38 evreye kadar 5 kurbağa embriyosuna veya 7 zebra balığı embriyosuna kadar 4 dpf kadar yerleştirebilir. </li><li> Embriyoyu analiz edinEd U kuruluşu için. </li></ol></li><li> Hipoksi ve EdU birleşmesinde embriyo kuluçka süresinin zamanı <ol><li> Seçiminizdeki 500 mL embriyo ortamı ile gaz inkübasyon odasını doldurun. Gaz tüpünü,% 5 O 2 ve% 95 N 2 gaz karışımı içeren gaz silindirine bağlayın ve ortamı gaz karışımı ile 15 dakika dengeleyin. </li><li> Embriyoları hipoksik bölmeye aktarın, bunları eşit olarak kuyular arasında dağıtın ve 48 saate kadar istenen zaman periyodu boyunca inkübe edin. Son 1 saat boyunca, embriyo ortamını,% 1 v / v DMSO ile takviye edilmiş 5 mM EDU çözeltisi ile değiştirin. </li><li> Embriyoları normoksik çanağa geri aktarın ve EdU&#39;ya katılmayı analiz edin. </li></ol></li><li> EdU dahil etme algılama ve analizi <ol><li> 0.4 mg / mL MS222 solüsyonu ile banyo yapılarak embriyoları anestezikleyin. </li><li> Embriyoları uygun bir cam şişeye aktarın ve 2 ha için fiksasyon çözeltisi içinde inkübe ederek düzeltinT RT veya O / N 4 ° C&#39;de. PBS&#39;de 3 x 10 dakika yıkamayla izleyin. Doku soğuk koruması için embriyoları sakaroz çözeltisine dikkatli bir şekilde aktarın. Embriyolar cam flakona altına batmayana kadar 4 saat inkübe edin. </li><li> Embriyoları gömme ortamına yerleştirin (optimum kesme sıcaklığı bileşiği). Cryosection, embriyolarla derhal bloke eder veya -80 ° C&#39;de 14 d&#39;ye kadar depolayabilir. </li><li> Bir kriyostat kullanarak embriyolar içeren blokların kriyoteksiyonu. Mikroskop lamları üzerinde 12 μm (zebra balığı embriyoları) veya 16 μm (kurbağa embriyoları) kalınlıkları toplayın ve kurumaya bırakın. Dondurma bölmelerini derhal işleyin veya -20 ° C&#39;de 3 aya kadar saklayın. </li><li> EdU birleşmesini, ticari bir kimya kiti kullanarak immünofloresan boyayla tespit edin. Üreticinin tanımladığı şekilde deneydeki kriyoteksiyon sayısı için gerekli olan EdU Reaksiyon Karışımı miktarını hazırlayın. <ol><li> 500 uL Edsu Reaksiyon Karışımı için, 430 uL 1X EdU reaksiyon tamponu, 20 uL CuS04, 1.2 uL Alexa Fluor azid, 50 uL 1X EdU tampon katkı maddesi. </li></ol></li><li> Cryosections bir kez PBMT ile permeabilize gömülü ortam ve 3 x 5 dakika kaldırmak için PBS ile yıkayın. Dondurma bölmelerini Bloke etme çözümünde 30 dakika inkübe edin. </li><li> Cryosections Edu Reaksiyon Karışımı ile 1 saat süreyle inkübe edin ve ardından PBST&#39;de 3 x 10 dakika yıkayın. Kriyoseksiyonları 15 dakika boyunca DAPI çözeltisi ile, ardından PBST&#39;de 3 x 10 dakika yıkayın. Mount orta lekeli cryosections ile slaytlar monte lamelleri ile kapak ve bir floresan mikroskop altında analiz veya 1 yıl kadar 4 ° C&#39;de saklanmadan önce kurumaya bırakın. </li><li> Ters çevrilmiş konfokal tarama mikroskopu altında anti-EdU boyama ile cryosections analiz ve dijital kantifikasyon kullanarak EdU-pozitif hücrelerin sayısını belirlemek. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-altitude+physiology+and+pathophysiology:+implications+and+relevance+for+intensive+care+medicine.">High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine.</a> Crit Care. 11 (1), 203 (2007).</li><li>Grant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+level+and+acute+responses+to+hypoxia:+do+they+predict+physiological+responses+and+acute+mountain+sickness+at+altitude?.">Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?.</a> Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).</li><li>Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor-binding+protein-1+(IGFBP-1)+mediates+hypoxia-induced+embryonic+growth+and+developmental+retardation.">Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation.</a> PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).</li><li>Ong, K. K., Dunger, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+growth+failure:+the+road+to+obesity,+insulin+resistance+and+cardiovascular+disease+in+adults.">Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults.</a> Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).</li><li>Maxwell, P., Salnikow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1:+an+oxygen+and+metal+responsive+transcription+factor.">HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor.</a> Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).</li><li>Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+genes+encoding+glycolytic+enzymes+by+hypoxia-inducible+factor+1.">Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).</li><li>Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cobalt+inhibits+the+interaction+between+hypoxia-inducible+factor-alpha+and+von+Hippel-Lindau+protein+by+direct+binding+to+hypoxia-inducible+factor-alpha.">Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha.</a> J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).</li><li>Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+HIFs,+buts+and+maybes+of+hypoxia+signalling+in+disease:+lessons+from+zebrafish+models.">Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mimetic+agents+desferrioxamine+and+cobalt+chloride+induce+leukemic+cell+apoptosis+through+different+hypoxia-inducible+factor-1alpha+independent+mechanisms.">Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms.</a> Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).</li><li>Woods, I. G., Imam, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+severe+hypoxic+stress+during+development+in+zebrafish.">Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish.</a> Genom Data. 6, 83-88 (2015).</li><li>Rouhi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+metastasis+model+in+embryonic+zebrafish.">Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).</li><li>Stevenson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+disruption+of+vertebrate+CAN+pathfinding+through+EphrinB2+is+rescued+by+magnesium.">Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium.</a> PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).</li><li>Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient-Deprived+Retinal+Progenitors+Proliferate+in+Response+to+Hypoxia:+Interaction+of+the+HIF-1+and+mTOR+Pathway.">Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway.</a> J Dev Biol. 4 (2), (2016).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, D. P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).</li><li>McDonough, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+Culture,+and+Analysis+of+Xenopus+laevis+Embryonic+Retinal+Tissue.">Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue.</a> JoVE. (70), (2012).</li></ol>

Yazarlar rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Burada, kurbağa ve zebra balığı embriyolarıyla kullanılmak üzere ayarlanmış, ancak diğer su organizmaları için de uygun olan hipoksiyi indüklemek için kolay ama sağlam yeni bir yöntem sunduk. Bu yöntemin en büyük avantajı basitliği ve maliyet etkinliğidir. Bununla birlikte, bu yöntemle elde edilen sonuçlar çok sağlamdır. Hipoksinin odadaki hem tüm embriyolar hem de spesifik doku - burada retinalar - içinde etkili bir şekilde indükte edilebileceğini gösterdik. Hipoksi indüksiyonunun etki...

Hypoxia araştırması çok sayıda uygulamaya sahiptir. Bunlar, hipoksi 1 ve akut yüksek rakım hastalığı 2 ile karakterize edilen tıbbi koşullar için patogenezi araştırmak ve tedavileri geliştirmektir. Hipoksik stres, oksijen gerektiren tüm organizmalarda önemli metabolik değişikliklere neden olur. Hipoksik stres ayrıca fetusun büyümesini ve gelişimini ve intrauterin büyüme kısıtlamasını da içeren çeşitli insan hastalıklarının patogenezini etkiler. Hipoksik stres, doğum kilosunun, fetal ve neonatal mortalitenin azalmasına neden olmakla kalmaz, aynı zamanda kardiyovasküler hastalık, tip-2 diyabet, obezite ve hipertansiyon 4 gibi yetişkinlikte birçok komplikasyona neden olabilir. Hipoksik stres, sıklıkla tümörün gelişimi sırasında, tümör dokusu kan dolaşımını zorlaştıracağında da görülür. Bu nedenle , in vivo ve doğrudan embr sırasında hipoksi etkilerini incelemek mümkün önemlidir<html> Yonic gelişme. Gelişme sırasında hipoksi etkilerini incelemek için kullanılan en iyi bilinen yöntemler arasında, büyüme ortamında kobalt klorür kullanılması veya organizmanın hipoksit bir bölgede kuluçkalanması bulunur. Kobalt klorür, proteozomal bozunmayı önleyerek hipoksi-indüklenebilir faktör-1 alfa (HIF-1α) &#39;nın stabilizasyonundaki rolü nedeniyle yapay olarak normal oksijen konsantrasyonu altında hipoksik bir tepki uyandırır 5 , 6 , 7 . Bununla birlikte, uygun bir yöntem olan 8 , kobalt klorür ve diğer benzer kimyasal hipoksi mimetiklerinin kullanımı, hücreler ve dokular üzerinde spesifik olmayan zararlı etkilere, örneğin apoptoz 9&#39;a neden olabilir . Dolayısıyla, hipoksik odalar normal gelişim sürecinde canlılardaki &quot;doğal hipoksi&quot; oluşumunda daha iyi bir yöntemdir. Ntent &quot;&gt; Suda yaşayan hayvan embriyolarında hipoksi teşvik sistemi geliştirmeye odaklandık Hem kurbağalar hem de zebra balığı birçok biyolojik sürecin yanı sıra çeşitli insan hastalıkları modelleri için omurgalı model organizmalar haline geldi Frog ve zebra balığı embriyoları Maternal tazminatın komplikasyonunu ortadan kaldırarak harici olarak gelişir.Ayrıca, hızlı bir gelişim seyri, çevresel faktörleri manipüle etmeyi ve organ oluşumundaki fenotipik değişiklikleri gerçek zamanlı olarak gözlemlemeyi mümkün kılar.Ayrıca, büyük sinyal iletim yollarının birçok bileşeni, Bu model organizmalar ve geniş bir literatür tarafından detaylandırılmışlardır Kurbağalar ve zebra balığı embriyolarının hipoksinin omurgalıların gelişimi üzerindeki etkilerini incelemekteki ana avantajı oksijenin embriyolara çabucak nüfuz etmesi nedeniyle tüm proseslerin doğrudan izlenebilmesidir. Böylece kurbağalar ve zebra balığı gibi, diğer model organizmaların aksineFare embriyolarında, spesifik bir oksijen konsantrasyonunun etkisi, işlevsel vaskülatürün varlığını veya eksikliğini göz önüne almadan, ilgi dokusunda incelenebilir. Piyasada bulunan hipoksik inkübasyonun çoğu kurulumu, karşılaştırılabilir büyüklükte ve buna bağlı olarak yüksek işletme maliyetlerine sahip olma dezavantajına sahiptir. Yüksek başlangıç ​​maliyeti ve gaz tüketiminin yanı sıra, ortak hipoksi odalarının dengelenmesi ve bakımı, daha büyük boyut ve / veya organizma solunumundan dolayı doğal olarak bu odacıklarda oluşan gaz gradyanına karşı sabit hipoksik atmosferin sürdürülmesini gerektirir. Bu, gaz fanlarının ve soğutma sisteminin kullanılmasını gerektirir; bu soğutma sistemi, gerekli ek donanım miktarını arttırır, araştırmacının becerisini engeller ve genel olarak deneysel prosedürün basitliğini azaltır. Buna karşın, burada sunduğumuz kurulum, karşılaştırılabilir sağlam ancak çok düşük maliyetli, küçük, kurulması kolay ve fAst gazı dengelemesi, dengeli hipoksik atmosfer ve odacık içindeki malzeme ve solüsyonların basit bir şekilde değiş tokuşu. Sistemimiz, herhangi bir suda yaşayan herhangi bir organizma organizmasıyla kullanılmak üzere istihdam edilebilir. Elverişli olarak küçük olan ve dolayısıyla herhangi bir sıcaklıkta deneysel prosedürlere kolayca izin veren ortak bir laboratuvar inkübatörüne yerleştirilebilen bir hipoksik oda oluşturduk. Ortamda oksijen konsantrasyonunun yanı sıra sıcaklığın uygun bir şekilde kontrol edilmesini sağlayarak, sistemimizin piyasada bulunan hipoksi inkübatörlerine karşı avantajı küçük boyut ve maliyet etkinliğidir. Dolayısıyla, kurulumumuz, araştırma laboratuvarlarının çoğunluğu için mevcut olan genel laboratuar malzemeleri kullanılarak kurulabilir ve pahalı malzemeler gerektirmez. Ek olarak, kurulumumuz piyasada bulunan hipoksi inkübatörlerinin aksine ısı üretmez ve oda sıcaklığının altındaki sıcaklıklarda inkübatöre konulmasını sağlar. LaSt özellikle gelişimsel ve metabolik oranlara sıcaklığa bağlı olan kurbağalar ve balık gibi soğuk kanlı organizmalar ile çalışmak için kritik önem taşır. Çok düşük maliyetli ve kolayca kurulabilen gaz kuluçka haznemiz, çeşitli hipoksik veya hiperoksik koşulların oluşturulmasında çok yönlüdür ve geniş bir deney koşulları için farklı ortam ve solüsyonların hızlı ve kolay uygulanmasını sağlar. Buna ek olarak, yaygın olarak kullanılan tabaklar veya laboratuvar tankları yerine 10&#39;luk , 11&#39;inci , 12&#39;li olmak üzere 24&#39;lü bir plak kullanan sistemimiz, aynı anda birkaç mutant koşulun gözlemlenmesine ve deneysel olarak işlemesine izin verir. Doğru hipoksinin indüksiyonunu kontrol etmek için Western blot tespiti ile HIF-1α protein seviyelerini izledik. Buna ek olarak, inkübasyondan önce ve sonra çoğalan hücrelerin sayısıHipoksik odadaki n, dokuda hipoksi oluştuğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu yöntem, hipoksi öncesi embriyonik retinal kök hücre nişinde çoğalmanın azaldığını gösteren daha önce yayınlanmış sonuçlarımıza 13 dayanır. Bu nedenle, embriyo ortamına 5-etinil-2&#39;-deoksiuridin (EdU) ekleyerek ve yeni çoğalmakta olan hücrelerin DNA&#39;sına dahil edilmesini ölçerek retinal kök hücre çoğalmasının seviyesini izledik.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>KCl/0.1x MBS, Embryo mediu,</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>0.1x MBS</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, Embryo medium</td></tr><tr><td>Calcium nitrate</td><td>Sigma</td><td>202967</td><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, Embryo medium</td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>Embryo medium</td></tr><tr><td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>CG10</td><td>Frog fertilization</td></tr><tr><td>Zebrafish breeding tank</td><td>Carolina</td><td>161937</td><td>Gas chamber construction</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction</td></tr><tr><td>Epoxy resin</td><td>RS Components UK</td><td>Kit 199-1468</td><td></td></tr><tr><td>Gas distributor valve</td><td>WPI Luer Valves</td><td>Kit 14011</td><td>Aquatic tank attachment (Schema 1, &lt;strong&gt;H&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>High precision gas valve</td><td>BOC&amp;nbsp;</td><td>200 bar HiQ C106X/2B</td><td>Gas tank attachment (Schema 1, &lt;strong&gt;I&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>5% oxygen and 95% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>BOC</td><td>226686-L</td><td>Hypoxic gas mixture</td></tr><tr><td>ceramic disc diffuser</td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Art&amp;nbsp;</td><td>Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005</td><td>Schema 1, &lt;strong&gt;J&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>silicone grease</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>VAC1100</td><td>Schema 1, &lt;strong&gt;K&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>oxymeter</td><td>Oxford Optronix&amp;nbsp;</td><td>Oxylite, CP/022/001</td><td>Hypoxic chamber setup</td></tr><tr><td>fibre-optic dissolved oxygen sensor</td><td>Oxford Optronix</td><td>HL_BF/OT/E</td><td>Hypoxic chamber setup</td></tr><tr><td>plastic pasteur pipette</td><td>Sterilin</td><td>STS3855604D</td><td>For embryo transfer</td></tr><tr><td>MS222&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td>Embryo anesthetic</td></tr><tr><td>RIPA buffer&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R0278-50ML</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>Protease inhibitor</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>4x Laemmli loading buffer, 10x TBST</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer</td></tr><tr><td>beta-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Trizma base&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>5x Running buffer, Transfer buffer</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>5x Running buffer, Transfer buffer</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ML</td><td>10x TBST</td></tr><tr><td>skim milk powder</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td>Blocking Solution</td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge tube</td><td>Sigma</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>tissue homogenizer</td><td>Pellet Pestle Motor Kontes</td><td>Z359971</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>pellet pestles</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>precast 12% gel</td><td>Biorad</td><td>Mini-ProteinTGX, 456-1043</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>protein ladder</td><td>Amersham</td><td>Full-Range Rainbow ladder, RPN800E</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>nitrocellulose membrane (0.45 &amp;micro;m)</td><td>Biorad</td><td>162-0115</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-HIF-1&amp;alpha; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab2185</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-&amp;alpha;-tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T6074</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>goat anti-mouse antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97080</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Pierce ECL 2 reagent&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>80196</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>ECL films Hyperfilm</td><td>GE Healthcare Amersham</td><td>28906837</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>5-Ethynyl-2&amp;prime;-deoxyuridine &amp;nbsp;</td><td>santa cruz</td><td>CAS&amp;nbsp;61135-33-9</td><td>EdU, EdU incorporation</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>1x</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Fixation solution</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fluka</td><td>S/8600/60</td><td>Solution solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>PBST</td></tr><tr><td>Heat-inactivated Goat Serum (HiGS)</td><td>Sigma</td><td>G6767-100ml</td><td>Blocking solution (EdU incorporation)</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI, EdU incorporation</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU incorporation</td></tr><tr><td>glass vial</td><td>VWR</td><td>98178853</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>Tissue-Plus optimal cutting temperature compound&amp;nbsp;</td><td>Scigen</td><td>4563</td><td>Embedding medium, EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>cryostat Jung Fridgocut 2800E</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3035S</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>microscope slides Super-Frost plus Menzel glass</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>EdU Click-iT chemistry kit</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>FluorSave</td><td>Calbiochem</td><td>D00170200</td><td>Mounting medium, EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>coverslips</td><td>VWR</td><td>ECN631-1575</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>confocal scanning microscope</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>Volocity software</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr></tbody></table>

induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos

Burada, kurbağa ve zebra balığı embriyoları gibi su organizmalarında hipoksinin etkilerini incelemek için geliştirdiğimiz hipoksi indüksiyonu için yeni bir sistem sunuyoruz. Sistemimiz, seçime bağlı herhangi bir deneysel solüsyonda spesifik bir oksijen konsantrasyonunu ve sıcaklığını sağlamak ve korumak için sağlam olan basit bir düzen içeren bir hazneyi içermektedir. Sunulan sistem çok uygun fakat son derece fonksiyoneldir, in vivo doğrudan deneyler için ve 48 saate kadar çeşitli zaman periyodlarında indüksiyon ve hipoksinin sürdürülmesine izin verir. Hipoksinin etkilerini izlemek ve incelemek için iki yöntem kullandık - tüm embriyolar veya spesifik dokularda hipoksi ile uyarılabilir faktör 1alfa (HIF-1α) seviyelerinin ölçülmesi ve retinal kök hücre çoğalmasının belirlenmesinde 5-etinil-2&#39;- Deoksiuridin (EdU) DNA&#39;ya dahil edilmesi. HIF-1α seviyeleri tüm embriyo veya dokuda genel hipoksi belirteci olarak görev yapabilirBurada, embriyonik retina seçimi. Embriyonik retinanın çoğalan hücrelerine EdU&#39;nun dahil edilmesi hipoksi indüksiyonunun spesifik bir çıktısıdır. Böylece, hipoksik embriyonik retinal progenitörlerin hem kurbağa hem de zebra balığı embriyolarının% 5&#39;inin oksijen altında inkübasyonun 1 saat içinde proliferasyonu azalttığını gösterdik. Hakim olduktan sonra, kurulumumuz, doğrudan in vivo deneyler için, herhangi bir belirli periyot için ve normal, hipoksik veya hiperoksit oksijen konsantrasyonu altında veya herhangi bir diğer verilen gaz karışımında, küçük su ürünleri model organizmaları ile birlikte kullanılmak üzere kullanılabilir.

Burada sunduğumuz hipoksik odacık sisteminin kullanılması, hipoksinin tek tek ve canlı tüm canlı hayvanlar üzerindeki etkilerinin incelenmesine olanak tanır. Hipoksi, tüm kurbağa veya zebra balığı embriyolarını hipoksik bölmeye ( Şekil 1 ) yerleştirerek indükleyebilir ve koşulların farklı kombinasyonları üzerinde üstlenilebilir. Tamamlanmış gaz odası yerleşiminin bir görüntüsü Şekil 2&#39;de</s...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos at JoVE.com

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Kurbağa ve zebra balığı embriyoları gibi suda yaşayan organizmalar için yeni bir hipoksik oda sistemi sunuyoruz. Sistemimiz basit, sağlam, düşük maliyetlidir ve in vivo ve 48 saate kadar hipoksinin indüklenmesine ve sürülmesine izin verir. Hipoksinin etkinliğini izlemek için tekrarlanabilir 2 yöntem sunmaktayız.

Kurbağa ve Zebra balığı Embriyolarında Hipoksinin İndüklenmesi

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

induction-of-hypoxia-in-living-frog-and-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K Görüntüleme.  University of Cambridge.  Kurbağa ve zebra balığı embriyoları gibi suda yaşayan organizmalar için yeni bir hipoksik oda sistemi sunuyoruz. Sistemimiz basit, sağlam, düşük maliyetlidir ve in vivo ve 48 saate kadar hipoksinin indüklenmesine ve sürülmesine izin verir. Hipoksinin etkinliğini izlemek için tekrarlanabilir 2 yöntem sunmaktayız. 

Video: Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Gelişim Biyolojisi

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Biyoloji

Zebra Balıklarında Optogenetik Sinyal Manipülasyonu ile Gelişimin İncelenmesi

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

Yazar Spotlight: Hücre Kaderi Kararlarını Çözmek için Zebra Balığı Embriyolarında Sinyalizasyonu Manipüle Etmek 

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

Zebra Balığı Embriyolarında Optogenetik Sinyal Aktivasyonu

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon Canlı Görüntüleme

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Nörobilim

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Kurbağa ve Zebra balığı Embriyolarında Hipoksinin İndüklenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Zebra Balığı Embriyolarında Optogenetik Sinyal Aktivasyonu

Zebra Balığı Embriyolarında Optogenetik Sinyal Aktivasyonu

Zebra Balığı Embriyolarında Optogenetik Sinyal Aktivasyonu

Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon Canlı Görüntüleme

Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar