İnsan beyin organoidleri kolayca manipüle ve bir insan ayarı ve birden fazla hücre türlerinin uygun etkileşim birleştiren bir sistemde hastalık çalışma için önemli bir araçtır. Bu teknik nörogelişimsel bozukluklar, toksik hakaretler ve beyinde kanser büyüme ve tedavisi de dahil olmak üzere beynin çok sayıda hastalıkları, çalışma için uygulanabilir. Bu protokolün en büyük avantajı nöronal hücre tipleri geniş bir yelpazede son derece tekrarlanabilir beyin organoidler oluşturmak için yeteneğidir.
Bu, çoğu laboratuvar tarafından gerçekleştirilebilir çok basit bir iş akışı kullanılarak yapılır. Ve bu çok basit ve maliyet etkin bir sistem yapma özel büyüme faktörleri veya tanımsız matrisetkisi olmadan geçici uygun bir şekilde üretilmektedir. Başlamak için, 15 mililitrelik konik bir tüpte 5,9 mililitre buz gibi donanması Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta veya F12 ortamı ile 100 mikrolitre matrisi birleştirin.
Her kuyuyu altı kuyulu bir tabakta, bir mililitre membran matrisi ile kaplayın. Plakayı parafin filmine sarın ve bir gecede dört santigrat derecede saklayın. Ertesi gün, her kuyudan fazla ortam aspire, F12 ile kuyuları durulayın ve iyi başına iki mililitre mTeSR1 medya toplam hacminde H9 hESCS ekleyin.
Kültür haftadan haftaya hücreleri. Günlük iki mililitre mTeSR1 ortam verin ve plakayı %5 oksijen ve %5 karbondioksit içeren 37 derece düşük oksijenli bir kuvöze yerleştirin. Pasajlar arasındaki kültürden ayırt edici hücreleri saymak için cam aletler kullanın.
Ortamı günlük olarak yenileyin. Hücreler organoid üretimi için H9 hücrelerini kullanmadan dört ila altı gün önce geçmelidir. Hücreleri geçiş için, DMEM F12 media ile durulayarak ve aşırı sıvı yıkarak başlayın.
Durulama sonra, proteaz çözeltisi ekleyin ve koloniler kuyu içinde yüzen için 40 dakika boyunca hücreleri kuluçkaya yat. Daha sonra, DMEM F12 kullanarak hücreleri üç kez yıkayın ve gerekirse parçaları daha küçük yapmak için titre. Daha sonra hücreleri dört altı kuyulu plakanın üzerinde yaklaşık bir-sekiz oranında dağıtın ve plakaları kuvöze yerleştirin ve günlük besleyin.
Dört ila altı gün sonra, hücreler yaklaşık% 80 birleşim ulaşır. Onları normal bir kuluçka makinesine geçirin. Her altı kuyuluk hESCS plakası başına beş mililitre DMEM veya F12 ortamına bir mililitre stok çözeltisi ekleyerek proteaz stok çözeltisini çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
Aspire ve hücre kültürü medya kaldırmak, sonra proteaz çözeltisi ile hESCS kapağı. 10 ila 15 dakika boyunca kuvözde plakaları yerleştirin veya kolonilerin kenarları yuvarlak kadar ve matris ayrı başlar ama tamamen yuvarlanmadan önce. Plakayı yatırın, proteaz çözeltisini aspire edin ve hücreleri her üç kez iki mililitre DMEM veya F12 ile nazikçe yıkayın.
Kolonilerin matrise bağlı kaldığından emin olun. Bu yüzden ES hücrelerinin parçalarının uygun boyutta olması çok önemlidir, bu yüzden uygun süre boyunca yok olmadıklarından emin olun. Eğer orada çok kısa bir süre kalıyorlarsa, onları sifonu çekip ayırmak çok zor olabilir.
Ve eğer orada çok uzun süre kalırsalar, yıkama merdivenlerinde çıkabilirler. Her kuyuya yaklaşık 1 ila 1,5 mililitre taze mTeSR ortam ekleyin ve nazik pipetleme kullanarak plakadaki hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe boşaltın. Aspire edin ve hESCS'yi orijinal boyutlarının yaklaşık 1/30'una ulaşana kadar plaka içinde dağıtın.
Koloni kümeleri 250 ila 350 mikrometre boyutundaki parçalara benziyor. Hücreleri, bFGF olmadan 30 mililitre mTeSR ortam içeren tek bir ultra düşük eki T75 şişesine aktarın. Ertesi gün, şişeyi köşede canlı hücreler biriktisi gibi yatırın.
Şişenin altına yapışmış çok sayıda hücre varsa, hücreleri yeni bir şişeye aktarmak için 10 mililitrelik pipet kullanın. İlk birkaç gün için ölü hücrelerin yüksek bir nüfusa sahip bekliyoruz. Hücreler yerleştikten sonra, canlı hücreleri içeren yaklaşık 10 mililitre medya bırakarak medya ve ölü hücreleri aspire ve bFGF mililitre başına 30 nanogram ile desteklenen düşük bFGF medya 20 mililitre ekleyin.
İki gün sonra hücreleri kontrol edin. Hücrelerin çoğu sağlıklı ve parlak görünmelidir. Ancak, hücrelerin üçte birinden fazlası koyu görünürse, şişeyi yatırın ve 20 mililitre lik ortamı 20 mililitre düşük bFGF medya ile değiştirin ve mililitre başına 20 nanogram bFGF ile destekleyin.
Üçüncü gün, ortamın yarısını çıkarın ve 15 mililitre hESC medya ile birlikte bFGF mililitre başına 10 nanogram ile değiştirin. Beşinci günde, medyanın yarısını 15 mililitre nöral indüksiyon media ile değiştirin. Bundan sonra, her gün, nöral indüksiyon ortamı ile orta yarısını değiştirin.
Kültürde üç hafta sonra, istenirse 1X son konsantrasyonunda medyaya 100X Penisilin-Streptomisin ekleyin. Her gün ortamın yarısını yenileyin. Bu protokolde, oluşan beyin organoidleri bu kümelerin merkezlerinde karanlık ölüm hücreleri olmadan parlak ve benzer boyutlarda görünüyordu.
Hücreler yavaş yavaş bFGF kapalı kesildi. Beşinci gün, nöral indüksiyon ortamına yerleştirildiler ve kültür dönemi boyunca bu medyada kaldılar. Organoidler zamanla daha büyük ve böylece koyu olmasına rağmen, nöral rozet benzeri yapılar nöral farklılaşmanın başlangıcını gösterir ve embriyonik nöral tüpün özelliklerini içeren genişledi.
Hücrelerdeki gen ekspresyonuna daha derinlemesine bakmak için qPCR analizi yapıldı. Glutamat taşıyıcı VLGUT1 iki buçuk hafta ifade edildi, beş hafta arttı, ve kültür beş ay boyunca tutarlı kaldı. Bir önbeyin belirteci Foxg1 kültür beş hafta kadar düşük seviyelerde ifade edildi.
Derin tabaka belirteci Tbr1 yaklaşık beş hafta doruğa ulaştı ve daha sonra azaldı. Üst tabaka belirteç Satb2 ifadesi ise, ventral marker Eng1, arka beyin omurilik marker Hoxb4, yanı sıra oligodendrocyte marker Olig2 tüm zamanla arttı. Buna karşılık, kök hücre belirteci Sox2 zaman içinde azalmıştır.
Glial marker GFAP beş hafta zirveye ve daha sonra nispeten sabit kaldı. Onlar antibiyotik olmadan yetiştirilen konum ve aynı zamanda programa göre beslenmeyi unutmayın gibi kontaminasyonu önlemek için erken evre organoidler ES hücreleri ele yaparken azami dikkat etmeyi unutmayın. Bu prosedürü takiben, gen ekspresyonu için kantitatif RT-PCR ve protein ekspresyonu ve lokalizasyon için immünofloresans gibi teknikleri kullanarak organoidleri değerlendirebilirsiniz.
Bu tekniği kullanarak, hipoksi odasında modellenen insan neonatal hipoksik yaralanma yönlerini hafifletmek için küçük bir molekülün yeteneğini incelemek başardık. Bu insan beyin organoidlerinin in vivo fare deneylerine benzer şekilde olması önemlidir.
