Bu yöntem, hücre kültürü deneyleri için donatılmış herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir. Bu yöntemi kullanarak, böbrek gelişimi ve hastalık yolları hakkındaki anlayışımızı ilerletebiliriz. Bu, böbrek organoidleri üretmek için diğerlerine kıyasla nispeten basit ve ucuz bir yöntemdir.
Bu tekniğin en büyük zorluğu, yüksek kaliteli insan pluripotent kök hücre kültürünü korumaktır. Hücrelerin% 80'den daha az bir yoğunlukta tutulması ve düzenli olarak bölünmesi çok önemlidir. İnsan pluripotent kök hücre kültüründe yeni olan araştırmacılar, farklılaşmaya geçmeden önce kök hücre hatlarına aşina olmalıdır.
Böbrek organoid tahliline, altı kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna iki mililitre tam E5-ILP ortamı ekleyerek başlayın. İnsan pluripotent kök hücrelerini veya hPSC'leri, 100 milimetre doku kültürü ile muamele edilmiş plakalarda% 60 akıcılığa ulaşana kadar kültürleyin. hPSC'leri yaklaşık sekiz mililitre DPBS ile iki kez yıkayın.
DPBS'yi aspire edin, ardından hücreleri örtmek için damla damla iki mililitre Dispase ekleyin ve 37 santigrat derecede altı dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri yaklaşık 10 mililitre DPBS ile üç kez yıkayın. DPBS'yi aspire edin, ardından plakayı 45 derece eğin ve hücreleri bir hücre kaldırıcı ile kazıyın.
10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak kolonileri üstten altı mililitre tam E5-ILP ortamı ile yıkayın. Daha sonra, pipeti dikey olarak tutarak, kültür plakasının kenarlarına dokunmamaya dikkat ederek, yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek, büyük kolonileri parçalayın. Altı kuyucuklu plakaya kuyu başına bir mililitre ekleyerek koloni kümelerini eşit olarak dağıtın, ardından plakayı 37 derecelik bir santigrat inkübatörün içindeki yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin.
Alternatif olarak, bir orbital çalkalayıcı mevcut değilse, hücreler statik olarak kültürlenebilir. İkinci günde, embriyoid cisimlerin plakanın dibine yerleşmesine izin verdikten sonra, plakayı 45 derece eğin ve ortamı üstten yavaşça aspire ederek kuyucuk başına bir mililitre bırakın. Kuyucuk başına iki mililitre hazırlanmış tam ortam ekleyin ve plakayı çalkalayıcıya geri döndürün.
Üçüncü günde, daha önce gösterildiği gibi ortamı aspire ettikten sonra, 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak tüm embriyoid cisimleri her bir kuyucuktan dikkatlice toplayın ve 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın. Kalan embriyoid cisimleri toplamak için, her bir kuyucuğu bir mililitre düşük glikozlu DMEM ile durulayın ve bunları aynı 50 mililitrelik konik tüpe ekleyin. Embriyoid cisimlerin tüpün dibine yerleşmesini beklerken, altı kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna iki mililitre Aşama II orta ekleyin.
Daha sonra, yeni bir 50 mililitrelik konik tüpün üzerine 200 mikrometrelik bir hücre süzgeci yerleştirerek ve tüm embriyoid cisimleri hücre süzgeci üzerinde dikkatlice pipetleyerek büyük embriyoid cisimleri eleyin. Süzgecin içine sıkışmış embriyoid cisimleri toplamak için hücre süzgecini ilave beş mililitre DMEM ile durulayın. Daha sonraki aşamalarda, önce çok büyük embriyoid cisimleri elemek için 500 mikrometrelik bir süzgeç kullanın, daha sonra tübülsüz çok küçük embriyoid cisimleri elemek için filtratın 200 mikrometrelik bir süzgeçten geçirilmesi.
200 mikrometrelik süzgeci 50 mililitrelik yeni bir tüpe çevirerek ve süzgeci DPBS ile yıkayarak 200 ila 500 mikrometre arasında doğru boyutta embriyoid gövdeleri toplayın. Süzdükten sonra, embriyoid cisimlerin konik tüpün dibine yerleşmesine izin verin, daha sonra süpernatanı aspire edin ve yaklaşık 10 mililitre DMEM ile yıkayın. Daha sonra, embriyoid cisimleri altı mililitre Aşama II ortamında yeniden askıya alın.
Embriyoid cisimleri altı kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasına geri aktarın ve kuyucuklar arasında eşit olarak dağıtın. Organoidlerin çoğu pipetin tepesinde toplandığından, sonunda yaklaşık yarım mililitre bırakın, ardından ucu her bir kuyucuktaki ortama hafifçe dokundurarak organoidlerin kuyuya akmasına izin verin. Embriyoid cisimleri, 45 mililitre Aşama II ortama sahip 125 mililitrelik bir iplikçi şişesine aktarın.
Manyetik karıştırma hızını 120 rpm'ye ayarlayın ve şişeyi inkübatöre yerleştirin. Embriyoid cisimleri veya böbrek organoidlerini beslemek için, iplikçi şişenin dibine kısa bir süre yerleşmelerine izin verin, ardından kapağı şişenin bir yan kolundan kaldırın ve aspire edici pipeti, ucu karşı iç duvara değecek şekilde içine yerleştirin. Pipetin yavaşça aşağı doğru açılı olmasını sağlayın ve ortamın yaklaşık yarısını aspire edin.
Aynı açıklıktan pipetleyerek, 20 mililitre taze Stage II ortamı ile doldurun. Embriyoid gövdeli veya böbrek organoidleri içeren altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna dikkatlice bir manyetik karıştırma çubuğu yerleştirmek için uzun steril forseps kullanın. Plakayı altı tekerlekli manyetik karıştırma plakasına yerleştirin ve hızı 120 rpm'ye ayarlayın.
Manyetik karıştırma çubuklarının yerine oturması ve dönmeye başlaması için, önce güç seviyesini 100 olarak ayarlayın. Tüm çubuklar dönmeye başladığında, güç seviyesini 25'e indirin. Daha önce gösterildiği gibi ortamın yarısını değiştirerek böbrek organoidlerini koruyun.
14. gün böbrek organoidlerinin parafin kesitlerinin immünofloresansı, hepatosit nükleer faktör-1 beta ve Lotus tetragonolobus lektini eksprese eden renal tübüller gibi nefron segmentlerinin yanı sıra V-maf musküloaponevrotik fibrosarkom onkogen homolog B ve nefrin'i eksprese eden podosit kümelerinin varlığını göstermektedir. Bu protokoldeki modifikasyonlar, kültürün 26. gününde trombosit ve endotel hücre adezyon molekülü-1 ile boyanarak doğrulandığı gibi, endotel hücrelerinin genişlemesini destekleyebilir. İnsan pluripotent kök hücrelerinin uygun süre Dispase ile tedavi edilmesi, daha sonra tüm izleri gidermek için iyice yıkanması gerekir.
Dispase tamamen çıkarılmazsa, hücre ölümüne ve embriyoid cisimlerin kümelenmesine yol açabilir. Bu yöntem, konjenital böbrek hastalıklarının gelişimini, ayrıca çeşitli böbrek hasarı yollarını ve in vitro terapötik müdahaleler için potansiyeli incelememize yardımcı olmuştur.
