Bu yeni insan dişi kaynaklı organoid model, insan diş kök hücre biyolojisini diş rejeneratif uygulamalarına yönelik perspektiflerle deşifre etmek için ilk güçlü aracı sağlar. Şu anda, bu diş organoid modeli, insan dişi epitel kök hücrelerini güvenilir ve sağlam bir şekilde büyütmek ve genişletmek için mevcut tek araçtır. Bu organoid protokol, sadece sağlıklı değil, aynı zamanda diş tümörleri ve bakteriyel etki gibi hastalıklı dişlerden de araştırma modelleri oluşturmak için uygulanabilir.
Bu tür hastalık modellerinin araştırılması yeni terapötik hedefleri ortaya çıkarabilir. Bu organoid model, insan dişindeki emaye oluşum sürecini deşifre etmede oldukça etkilidir ve üretici amaçlar için emaye gibi diş parçalarının yapımını sağlayabilir. Prosedürü gösteren, araştırma grubumdaki doktora öğrencisi Lara Hemeryck olacak.
Başlamak için, buz üzerine yerleştirilen toplama ortamında ilişkili diş folikülleri olan üçüncü azı dişlerini toplayın ve tüplerin içeriğini bir Petri kabına aktarın. Dişi cımbızla tutun ve cerrahi bir bıçak kullanarak diş foliküllerini dikkatlice izole edin. Kalan kanı diş foliküllerinden 20 saniye boyunca %70 etanolün ilk kuyucuğuna kısaca yerleştirerek yıkayın, ardından 20 saniye boyunca bir sonraki ölüm etanol plağına ve üçüncü etanol kuyucusuna aktarın.
Fosfat tamponlu salin kuyucuklarında üç kez durulamaya devam edin, ardından kalan üç diş folikülü toplama ortamı kuyucuklarındaki diş foliküllerini toplamda en fazla 20 dakika boyunca durulayın. Durulanmış diş foliküllerini yeni bir Petri kabına aktarın. Paraformaldehit fiksasyonu için diş foliküllerinden birinin küçük bir parçasını kesin ve en fazla altı saat boyunca 500 mikrolitre toplama ortamı içeren bir mikrosantrifüj tüpünde saklayın.
Diş köklerinin geri kalanını küçük parçalara ayırın ve dört mililitre önceden ısıtılmış ayrışma ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından tüpü su banyosunda iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Her 15 dakikada bir, diş folikülleri ayrışma ortamını pipetleyin ve doku parçalanmasını hızlandırmak için bir cam pipet kullanarak yukarı ve aşağı karıştırın. Diş folikülü parçaları artık gözlenmediğinde, daralmış, ateşle parlatılmış bir Pasteur pipet kullanarak ayrışmaya devam edin.
Bu arada, 100 mikrolitre DNaz içeren 10 mililitre orta A hazırlayın ve ayrışmış diş köklerine sahip her tüpe bu ortamın beş mililitresini ekleyin. Oda sıcaklığında bir dakika kuluçkaya yatırın. Filtreyi bir mililitre orta A. Bu adımda bir hastadan ayrışmış diş köklerinin birkaç tüpünü birleştirin ve filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj edin.
Süper natantı çıkarın. Peleti bir mililitre serumsuz tanımlanmış ortamda yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu hesaplayın ve tohumlanabilecek kuyu sayısını hesaplayın.
Son karışım, 30 ila 70 oranında hücre süspansiyonu ve bazal membran matrisinden oluşur. Uygun miktarda süpernatantı çıkarın ve 70 ila 30 oranında buz gibi soğuk bazal membran matrisinin kaplama için hücre süspansiyonuna oranını elde etmek için yavaşça yeniden askıya alın. Bodrum membran matrisinde yeniden askıya alındıktan sonra, bazal membran matrisinin katılaşmasını önlemek için mikrosantrifüj tüpünü buz üzerinde tutun.
Pipet, 20 mikrolitrelik bazal membran matris damlacıklarının ortasındaki önceden ısıtılmış 48 delikli kültür plakasıdır. Plakayı baş aşağı çevirin ve 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede% 1.9'luk bir karbondioksit inkübatöründe katılaşacak şekilde yerleştirin. Diş organoid ortamına ro-ilişkili kinaz inhibitörü ve amfoterisin B ekleyin ve ortamı 37 santigrat derecelik bir su banyosunda önceden ısıtın.
48 kuyucuklu plakayı inkübatörden alın. Dik yerleştirin ve hazırlanan önceden ısıtılmış ortamın 250 mikrolitresini, hücreleri içeren bir bazal membran matris damlacığı ile her bir kuyucuğa ekleyin ve plakayı karbondioksit inkübatörüne geri gönderin. Ortamı yenilemek için plakayı 45 derecelik bir açıyla eğin.
Bodrum zarı matris damlacığına dokunmaktan kaçınırken önceki ortamı nazikçe çıkarın ve her iki ila üç günde bir 250 mikrolitre yeni önceden ısıtılmış diş organoid ortamı ekleyin. Organoidlerin geçişini gerçekleştirmek için, ortamı organoidlerle kuyucuklardan çıkarın ve dört adede kadar akıcılık kuyusuna kadar havuzlayın. Organoidleri toplamak için, kuyu başına 400 mikrolitre buz gibi soğuk serumsuz tanımlanmış ortamı doğrudan membran matris damlacığı üzerine ekleyin ve tüm damlacık yerinden çıkana kadar ortamı tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyin.
Kuyular havuzlanırsa, damlacıkları içeren organoidi yerinden çıkarmak için 400 mikrolitreyi ilk kuyucuktan diğerine aktarın. Yerinden çıkmış organoid tertibatı 1.5 mikrolitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüm organoid yapılar kuyucuklardan toplanana kadar serumsuz tanımlanmış ortamın eklenmesini tekrarlayın. 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj yapın.
Süpernatantı santrifüj tüpünden çıkarın ve peleti önceden ısıtılmış bir TrypLE Express aliquot'unda yeniden askıya alın. Enzimi inaktive etmek için 400 mikrolitre buz gibi soğuk serum içermeyen tanımlanmış ortam ekleyin ve 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj edin. Süper natantı çıkarın.
Bir ucu buz gibi soğuk serumsuz tanımlanmış bir ortamla önceden kaplayın ve organoid peleti steril durumda tekrar askıya alın. Düşük geçişli yöntem için peleti 200 mikrolitre buz gibi soğuk serum serbest tanımlı ortamda tekrar askıya alın. Tamamen boşaltılmış pipet ucunu, çapını azaltmak için mikro santrifüj tüpünün tabanına doğru itin.
Organoidleri mekanik olarak bozmak için beş dakika boyunca yukarı ve aşağı pipet uygulayın. Daha yüksek geçiş yöntemi için, peleti P1000 uçlu 700 mikrolitre buz gibi soğuk serum içermeyen tanımlı ortamda yeniden askıya alın. Bu P1000 ucuna bir P200 uç ekleyin ve buz gibi soğuk serum içermeyen tanımlı ortamla ön kat yapın.
Pipetin ses seviyesi ayarını yaparak hava kabarcığı oluşumunu önleyin. Organoidleri mekanik olarak bozmak için orta hacmin en az %90'ını organoidler ve pipetlerle beş dakika boyunca yukarı ve aşağı doğru hedefleyin. Organoidler tipik olarak diş folikül hücresi tohumlamasından iki hafta sonra gelişir.
Organoidler uzun süreli 11 pasaja kadar genişletilebilir. Bodrum membran matris damlacığı başına yaklaşık 20.000 hücrenin tohumlanması, optimal bir organoid yoğunluğu sağlarken, daha yüksek hücre sayılarının tohumlanması, büyümek için yetersiz alan nedeniyle çok yüksek yoğunlukta benzer organoidlerle optimal olmayan organoid büyümesine yol açar. Geliştirilen organoidler yoğun bir görünüm sergiler ve yüksek nükleositoplazmik oran gösteren hücreler içerir.
Ayrıca, organoidler epitel kökenlerini ve P63, CD44 ve integrin alfa-6 gibi diğer önerilen ERM belirteçlerini doğrulayan ERM belirteci sitokeratin 14'ü eksprese eder. Organoidler, farelerde iyi bilinen bir DESC belirteci olan SOX2'yi eksprese eder. İlginç bir şekilde, emaye matrisinin ana bileşeni olan amelogenin, organoidlerde de ifade edilir.
Organoidler, belirteçlerin kararlı ekspresyonu ile gösterildiği gibi, pasaj sırasında ERMM sap fenotiplerini korurlar. Optimal uzun süreli organoid büyümesi için, önerilen geçiş yöntemlerinin anlamı veya düşük pasaj veya yüksek pasaj yöntemlerinin kullanılması esastır. Bir kez oluşturulduktan sonra, organoidler amelogenez sürecini daha fazla incelemek ve diş hekimliği araştırmalarında şu anda elde edilemeyen emaye matriks birikimini incelemek için kullanılabilir.
Bu teknik, dental epitel kök hücre biyolojisinin, mine oluşum sürecinin ve doğru diş oluşumu için gerekli bir etkileşim olan diş mezenkimi ile etkileşimin araştırılmasını sağlar.
