Çevremizde, özellikle östrojenik maddelerde yüksek sayıda EDC kimyasalı bulunmaktadır. Gruba ait maddelerin kimyasal çeşitliliği, tespitleri için farklı yöntemler gerektiğinden, testlerini zorlaştırır. Kimyasal yapısına dayanarak, bir madde aslında bir östrojen olarak çalışmak mümkün olup olmadığını belirlemek gerçekten zordur.
Buna ek olarak, bu maddeler çevrede saf bir formda mevcut asla, bu yüzden etkileri diğer bileşikler tarafından da etkilenmiş olabilir. Bu sorun, östrojen etkisi gösteren biyomonitör, biyoindikorganizmaların kullanımı gibi etki diyalektin yöntemleri ile çözülür. Bazı genlerin canlı organizmalarda östrojene duyarlı tepki verdiği bilinmektedir.
Gen ürünlerinin moleküler yöntemlerle saptanması protein veya mRNA düzeyinde de mümkündür, ancak genellikle hayvan kurban gerektirir. Hayvan koruma yasaları giderek katılaşıyor ve alternatif test sistemlerine yönelik talep giderek artıyor. Çapraz genetik teknolojiler bu gelişme ile olasılığı temsil eder ve floresan proteinlerin keşfi ile, biyomarker oluşturulması için yol döşeli edilmiştir.
Östrojen duyarlı genlerin böyle aktivasyonu yardımıyla in vivo test edilebilir. Bu videoda, vtg kullanımı için olası bir yöntem:1mCherry transgen zebrabalığı embriyoları iki bileşikler yardımıyla östrojenik maddelerin test için gösteriliyor. Protokol biyomarker embriyolar üzerinde farklı kimyasal veya çevresel örneklerin östrojen etkisini incelemek için bir arka plan olarak hizmet verebilir.
Deneylerimizde kullanılan zebra balığı serisi vitellogenin muhabiri transgenik zebra balığı serisidir. Hat Tol2 Transposon sistemi kullanılarak oluşturuldu. Geliştirme için kullanılan transgen yapısı, yüksek sayıda ERI tarafı olan uzun doğal vitellojenin-1 promotör dizisini taşımıştır.
Cinsel olgun kadın floresan sinyal in ifadesi süreklidir. Ancak, embriyolarda erkeklerde, sadece eylem veya östrojenik maddelerin varlığı ile görünür, bu yüzden ikincisi test etmek için daha uygundur. Hattın embriyoların duyarlılık ve kullanılabilirlik çeşitli östrojenik bileşikler yanı sıra çevresel örnekler üzerinde test edilmiştir.
Canlı hayvanlar üzerinde yapılan tüm deneyler Macar Hayvan Refahı Kanunu'na göre yapılmıştır ve hayvanlar serbest beslenme aşamasına gelmeden önce tüm çalışmalar tamamlanmıştır. Sistem suyu ile miyon tankları doldurun ve yumurta hasat önce kenetleme için balık kurmak. Erkek ve dişi balıkları tankın içine yerleştirin ve bölücü yardımıyla ayırın.
Ertesi sabah ışık lar yanarken bölücüyü tanklardan çıkarın. Her 15-20 dakikada bir yumurta için miyon tankları kontrol edin. Hasat bir çay süzgeci kullanarak tüm embriyolar, ya da yoğun dokuma, ince örgü, ve E3 tampon ile büyük bir Petri çanak içine birleştirmek, ya da sistem suyu temiz.
Embriyoları 25.5 santigrat dereceye ayarlanmış kuvözlere yerleştirin. Bir buçuk saat sonra, döllenmemiş veya plastik transfer pipetiyle yetersiz bölünmüş yumurtaları bir diseksiyon mikroskobu altında çıkarın ve atın. Seçilen embriyoları tedavi damarlarına, örneğin test maddesinin farklı konsantrasyonlarıyla etiketlenmiş ve doldurulmuş Petri kaplarına veya doku kültürü tabaklarına yerleştirin.
Deney bitene kadar embriyoları 25.5 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Tedavi konsantrasyonunu korumak için gerekirse test çözümlerini yenileyin. Embriyolara zarar vermemek için test çözümlerini değiştirirken dikkatli olun.
Önceden ms 222 ile yüzde dört methoseladose hazırlayın. Beş günlük larvaları plastik pipetle tedavi grubuna beş santimetrelik Petri kabına yerleştirin. Tedavi çözeltisini larvalardan plastik bir pipetle çıkarın ve petri kabını yüzde 0,02 ms 222 anestezik solüsyonla iki mililitre ile doldurun.
Özel olarak tasarlanmış 10 santimetre petri kabının her karesini yüzde dört methoseladose ms 222 ile doldurun. Anestezi edilmiş larvaları iki kareden birinde biraz su yla methoseladose'e aktarın. İlk kareden larvaları ikinci meydana aktarın.
İkinci karede, larvaları sol tarafına döndürün ve yönlendirin ve iki santimetreye kadar kesilmiş bir mikroyükleyici pipet ucuyla yavaşça altına bastırın. İfade edilen muhabirin sinyalini değerlendirmek için embriyoları aynı görünümde ve ayarlarda görebin. Petri kabını mikroskop un sahnesine yerleştirin.
Embriyonun karaciğerine odaklanın ve ilgili yazılımı kullanarak parlak bir alan görüntüsü yakalayın. Mikroskobu mCherry filtresine çevirin ve ilgili yazılımı kullanarak floresan ışık altında karaciğerin floresan bir görüntüsünü alın. Deneydeki tüm embriyoları yakalayana kadar önceki iki adımı tekrarlayın.
ImageJ'i açın, ardından görüntüyü sürükleyip bırakarak veya Dosya Aç'a tıklayarak analiz edilecek floresan görüntüyü yükleyin. RGB renk grafiğine göre floresan filtre tarafından yapılan görüntüyü bölmek için Resim, Renk, Split Kanalları'na tıklayın. Kırmızı kanal görüntü spektrumu yla çalışın.
Diğer kanalları kapatın. Görüntüde benzer büyüklükte bir eliptik alan belirleyin, böylece tam sinyaller değerlendirmeye engel olmaz. Oval araçları kullanarak mümkün olduğunca doğru olarak vurgulanan karaciğer alanı üzerinde bir elips çizin.
Sinyal zayıfsa, karaciğerin yerini belirlemek için floresan görüntünün parlak alan çifti olan ışık mikrospik görüntüleri kullanın. Sinyal gücünü ve etkilenen alanın boyutunu belirlemek için Analiz, Ölçü'ye tıklayın. Tümleşik yoğunluk değeri, grafikteki yazılım sütunu tarafından otomatik olarak hesaplanır.
Tedavi grubundaki tüm embriyoların floresan görüntülerini analiz edene kadar önceki adımları tekrarlayarak analize devam edin. Verileri kaydedin ve tümleşik yoğunluk değerlerini çözümle. Deneyde, biyomarker zebra balığı serisinin östrojene duyarlı embriyoları 5 güne kadar döllenme için 0.5 ve sekiz mikromol alfa-beta-Zearalenol veya ZOL konsantrasyonları ile tedavi edildi.
Deney sonunda balıkların karaciğerinde maddeler nedeniyle floresan sinyallerin görünüp görünmediğini ve iki maddenin östrojenisinde farklılıklar olup olmadığını araştırdık. Sonuçlar floresan görüntüler ve entegre yoğunluk değerleri temelinde değerlendirildi. Alfa-ZOL durumunda, en yüksek test konsantrasyonunda, tüm bireyler öldü.
Yani bu durumda floresan sinyal incelenemedi. Düşük konsantrasyonlarda, güçlü bir floresan sinyal embriyo karaciğerinde görülebilir. Floresan sinyalgücü ve ışıklı alanların boyutu önemli bir fark ile.
Entegre yoğunluk değerleri ile tedaviler arasında da anlamlı bir fark yoktu. Beta-ZOL ile tedavi sırasında mortalite yoktu. Madde tüm tedavi konsantrasyonlarında transgen aktivitesine neden oldu.
Floresan sinyal yoğunluğunun artması ve ışıklı alanın büyüklüğü, konsantrasyon arttıkça floresan görüntülerde gözlemlenebilir. Beta-ZOL'un entegre değerleri incelenerek bu değişiklik de keşfedilebilir. Ortalama entegre yoğunluk değeri en düşük ve en yüksek tedavi konsantrasyonları arasında neredeyse iki katına çıkar.
Ancak beta-ZOL durumunda bireysel konsantrasyonların entegre yoğunluk değerleri arasında anlamlı bir fark bulamadık. İki maddenin aynı tedavi konsantrasyonlarından elde edilen entegre yoğunluk değerleri inceleyerek, alfa-ZOL'un her olguda beta-ZOL'a göre daha yüksek entegre yoğunluk ortalamaları verdiği söylenebilir, bu da floresan görüntülerde gözlenen sinyal gücü arasındaki farklarla tutarlıdır. Tüm konsantrasyonlarda önemli olan bu farklılıklar.
Östrojen etkileri için biyogöstergelerin kullanımı toksikolojik çalışmalarda yayılıyor. Çalışmalarımızda vtg:1mCherry'nin kullanıldığı zebra balığından östrojen etkilerini gösteren çeşitli transgenik çizgiler de üretilmiştir. Burada açıklanan yöntem saf ajanlar durumunda östrojen aktivitesinin in vivo tespitine izin vermek için, bu hattın embriyoların test için olası bir protokol göstermektedir.
Embriyolarda transgenin ekspresyonunun, endojen vitellojenin üretimine benzer şekilde, büyük bir dağılım gösterdiğini ve deneyler tasarlanırken bireysel duyarlılık farklılıklarının göz önünde bulundurulması gerektiğini belirtmek gerekir. Tedavi konsantrasyonları belirlenmesinde önemli bir yönü, karaciğer hücreleri de dahil olmak üzere embriyo hücrelerinin, vitellogenin indüksiyon bir düşüşe yol açabilir yüksek toksik maddelerin yüksek konsantrasyonlarda zarar görebilir. Bu nedenle testler L-C 10'un altındaki konsantrasyonlarda yapılmalıdır.
Bu protokol, planlanan test bitiş noktalarına ve test edilecek örneklere göre birçok noktada değiştirilebilir. Diğer test yöntemleri ile tamamlanabilir, örneğin moleküler yöntemler. Böylece, vtg:1mCherry hattının kullanımının östrojenisite testlerinin bir modeli olarak görüneceğini ve standart test yöntemleri için bir model olabileceğini umuyoruz.
