Biz Susan Çiftçi ve Zebra balığı bakımı için UAB Zebrafish araştırma tesisi çalışanlarına teşekkür ederiz. Farmakoloji ve Toksikoloji Bölümü start-up fonları tarafından Award.

NOT: Bu protokol Birmingham Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi de Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1.. Zebra balığı Yetiştiriciliği ve Yumurta Koleksiyonlar <ol><li> Üç gün kimyasal maruz başlamadan önce, ayrı erkek ve kadınlar için bölücüler ile üreme tankları monte. Yetiştiricilik sistemi su ile her bir tank yarıya doldurun. Bir bölücü ayırarak her tankta 2 erkek ve 3 kadın yerleştirerek, üreme tanklarında c262/c262 balık: Bir ağının kullanılması, Tg (GFP 5xERE) aktarmak. Her tankın üzerinde bir kapak yerleştirin ve tarih ve çapraz olmak üzere suşları ile etiket. </li><li> Ertesi sabah, bütün engelleri kaldırmak ve eğim üreme tankının bir ucunda sığ bir alan yaratmak için perdeler. Zebra balığı kesin gelişimsel evreleme sağlamak için 10 dk aralıklarla embriyolar toplama, çiftleşmek için izin verin. Petri kapları içine E3B orta ve nazikçe yıkayın embriyolarını kullanarak bir çay süzgeci ile durulayarak temizleyin yumurta. Kalıcı yetişkin balık dönüntanklar. </li><li> Diseksiyon mikroskop kullanarak, sıralama, sayma, ve herhangi bir, döllenmemiş anormal veya hasarlı embriyolar kaldırmak. Karanlık döngüsü: 14:10 ışık ile 28.5 ° C&#39;de E3B orta ve evde Petri kapları içinde yer embriyolar. Embriyo yoğunluk gelişimini etkileyebilir. 60 x 15 mm tabak içinde bir 100 x 35 mm tabak en fazla 100 embriyolar ve en fazla 50 embriyolar yerleştirin. </li><li> 24 hpf tarafından, 200 uM 1-fenil-2-tiyoüre (PTU) içeren E3B ile medya değiştirin. PTU pigment oluşumunu önler ve zebra balığı embriyolar ve gelişmiş görüntü netliği için şeffaf larva tutar. DİKKAT: konsantre PTU stok tehlikelidir; E3B + PTU çözüm yaparken eldiven giyin. </li><li> 1 gün sonrası döllenme (DPF), elle ince forseps kullanarak her embriyo koryon çıkarın. Koryon östrojenlerin penetrasyonu etkileyecektir görünmüyor, ancak kaldırma görüntü netliğini artırır. Medyadan chorions kaldırmak için bir ihtiyaç vardır. Not: el Dechorionation için bir alternatif olarak, embriyo toplu che edilebilir11, daha önce tarif edildiği gibi mically, 1 mg / ml pronaz tedavi ile dechorionated. </li></ol> Embriyoların 2. Kimyasal Arıtma <ol><li> İşlemden önceki gün, 1000-kat DMSO konsantrasyonu (ya da uygun bir çözücü) her kimyasal stok çözelti hazırlayın. Örneğin, 10 uM, bisfenol A (BPA) için embriyolar maruz% 100 DMSO içinde bir 10 mM stok solüsyonu BPA hazırlamak. Bu, her bir tedavi muntazam bir DMSO konsantrasyonu sağlar ve DMSO içinde, toksik olmayan bir 1:1000 seyreltme, bir vasıta kontrolü olarak hizmet sağlar. -20 ° C&#39;de Mağaza stok çözümleri Bu protokol için, embriyolar 1 ve 10 uM BPA, 18.5 nM ve 1.85 mcM genistein, 367 nM östradiol (pozitif kontrol) ve araç (% 0.1 DMSO, negatif kontrol) maruz kalacağı. DİKKAT: BPA ve östradiol gibi kimyasallar tehlikeli ve insan fetus üzerinde zararlı etkileri olabilir. Dikkatle endokrin bozucular Kulp ve her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.</li><li> Tedavi gününde, çözülme hazır kimyasal çözeltiler hazırlanabilir. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpe 1 ml E3B + PTU pipetlenerek ve stok kimyasal çözelti 1 ul ekleyerek 1:1,000 sulandırmak. Vortex şiddetle. Bir vasıta kontrolü olarak E3B + propiltiyourasil&#39;i içine DMSO 1:1000 seyreltin. İşlem yapılmamış bir kontrol olarak, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 1 mL E3B + PTU kullanın. </li><li> 96 oyuklu bir plakanın her bir geniş çaplı plastik bir transfer pipeti, Petri tabaklarına transfer embriyolar kullanılarak, embriyolar per 3 de, durum başına 3 kuyu. Uzun süreli tedavi sırasında buharlaşmasını önlemek için, plakanın dış satırlar ve sütunlar (satırlar A ve E, kolon 1 ve 12) &#39;dan embriyolar sayın. Dış kuyu E3B + PTU 300 ul ile doldurulabilir. Uygun plaka kapağı etiketleyin. </li><li> Ince uçlu bir plastik transfer pipet ile her kuyu bulunan ortamı çıkarın. Embriyoların kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışır. </li><li> De karşılık gelen muamele çözeltisinin 200 ul ekleyin. Unde kapağı yerleştirinuygun kuyulara ilave tedaviler sağlamak için bir kılavuz olarak plaka rneath. Vortex her tüp çözelti içinde kimyasal dağıtmak için pipetleme önce. Görsel olarak, her embriyo muamele çözeltisi içinde olduğunu teyit. Embriyolar kuyunun tarafında ise, muamele çözeltisi ile iyice içine yıkamak için temiz bir aktarma pipeti kullanın. </li><li> 28.5 ° C&#39;de inkübatör plaka koyun Embriyolar 72 hpf floresan için analiz edilecektir. </li></ol> 96 oyuklu plakalar içinde Embriyolar 3. Otomatik Görüntüleme <ol><li> Her bir oyuğa, 4 mg / ml tricaine 10 ul ekleyerek embriyolar anestezisi. NOT: önce görüntüleme embriyolar anestezisi. 24-96 hpf, zebra balığı kendiliğinden hareket ve görüntü çekimi sırasında değişen ışık kaynağına bir irkilme tepkisi gösterirler. Embriyoların anestezi görüntüleme sırasında hareket azaltır. </li><li> Motorlu aşamasında 96 oyuklu plaka yerleştirin ve sahne kalibre edin. Zeiss Zen Mavi mikroskopi Automati için 2011 yazılımı kullanmave kontrol, numune taşıyıcı seçeneğini seçin ve çukurlu 96 seçin. kalibre seçin. Sahne kalibre adım adım yönergeleri izleyin. NOT: Bu adımdan sonra kiremit düğmesini işaretini kaldırın etmeyin. Fayans düğmesi işaretli ise, kalibrasyon ayarları kaybolabilir ve 96-plaka yeniden kalibre edilmesi gerekir. </li><li> Ayarı (BF), 10x objektif ve aydınlık kullanarak, bir pozitif kontrol embriyo tespit ve floresan sinyal kamerayı doyurarak değil emin, BF ve GFP kanallar için uygun pozlama ayarlarını. Tek embriyo odaklanın ve toplam 3 Z-bölümleri, yukarıda bir görüntü 50 mikron ve mevcut odak düzleminin altında bir 50 um elde etmek için mikroskop programlamak. NOT: Farklı dokular farklı odak düzlemleri işgal Çünkü her zebrabalıkları görüntüleri odak kalp ve karaciğer ile yakalanan için, bu sağlayacaktır. </li><li> GFP ve BF channe kullanarak bir kiremitli bir görüntü elde etmek için yazılım parametrelerini ayarlayınls. Satın alma sekmesi altında, gelişmiş ayarları seçin. Seç karo bölgeler, daha sonra fayans. Daire iyi seçeneği seçin. NOT: Fayans her oyuğa bileşik bir görüntü oluşturmak için kullanılır. Tek bir alan-of-view her iyi sadece küçük bir kısmını yakalar. Fayans fonksiyonu otomatik olarak tüm kuyunun bir kompozit görüntü oluştururken, alanlar-görünümü her kuyudan birden fazla bitişik yakalayabilir. Her kompozit görüntü tek bir kuyudan birkaç düzine bireysel görüntüleri içeren nerede, otomatik olarak plaka başına 96 kompozit görüntüler yakalamak mümkündür. </li><li> Taşıyıcıyı seçmek ve faktör% 90 doldurun. % 90 dolgu faktörü belirlemek, her bir kuyunun alanının% 90, kompozit görüntüde görülebilir olacağı seçilmiş kuyucuklara birden fazla çekim olacaktır. Not: dolgu faktörü seçilirken, bir diyagramdır, görüntülenecek olan alanı temsil görüntülenecektir. Kuyunun alanını içerecek bir yüzdesini seçinbu deney için uygundur. </li><li> Seçenekleri altında, istenilen örtüşme miktarını seçin. NOT: Tek bir temsili görüntü için birlikte fayans Dikiş zaman,% 5-10 bir örtüşme görüntüleri arasında düzgün bir dikiş sağlar. Görüntü dikiş gereksiz Ancak,% 0 örtüşme kullanarak görüntüleme süresini azaltacaktır. % 90 dolgu faktörü ve% 5 üst üste kullanılarak, tek bir kuyunun bir kompozit görüntü 59 tek tek görüntü oluşur. </li><li> Görüntüleme başlayın. Mikroskop görüntüleri otomatik olarak kazanacaklardır. </li><li> Elle doku-spesifik floresan için de her kompozit görüntüler (Şekil 1) inceleyin. </li><li> NOT: Bu kimyasal maruziyet öncesinde deneysel tedavi kuyuları gözlemleyerek çalıştı onaylamak için pozitif kontrol ile başlamak en iyisidir. </li></ol> 96 oyuklu bir plaka içerisinde Embriyolar 4. Manual Resim yakalama NOT: sonuçlarını onaylamak ac için 20x uzun çalışma mesafesi objektif kullanmak içinquire daha detaylı görüntüleri manuel (Şekil 2). <ol><li> Ayarı (BF), 20x objektif ve aydınlık kullanarak, bir pozitif kontrol embriyo tespit ve floresan sinyal kamerayı doyurarak değil emin, uygun BF ve GFP kanalları için pozlama ayarlarını. </li><li> Elle tek tek embriyo ve yakalama görüntüleri tespit. NOT: pozlama ayarları pozitif kontrol embriyo için seçildikten sonra, ayarları değiştirmek yok. Her bir görüntü muntazam koşullar altında yakalanır gibi bu floresan yoğunluğunun bir karşılaştırma sağlar. </li></ol>

<ol>
	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir maddi çıkarları var.

Bu protokol, zebra balığı embriyolar otomatik görüntü dokuya özel floresan için basit bir yöntem tarif edilir. Protokol, bir Zeiss Axio Observer kullanılarak geliştirilmiştir. Z1 Zen Blue 2011 yazılım ile, ancak teknik kompozit görüntüler oluşturmak için fayans gerçekleştirebilirsiniz motorlu bir sahne ve mikroskop kontrol yazılımı ile herhangi bir ters mikroskop kullanılarak adapte edilebilir. Motorlu bir sahne ile ters bir mikroskop donatılması yüksek içerik tarama için özel ekipman sat?...

Transgenik zebra balığı gibi fibroblast büyüme 1, retinoik asit 2 faktörleri ve canlı embriyolar, 3, östrojen gibi sinyal yolaklarına aktivite doğrudan görselleştirme için izin geliştirilmiştir. Bu tür araçlar (flüoresan yoğunluğundaki değişim olarak analiz) sinyal yolları bozmakta ve kimyasal ya da dokuya özel bir şekilde, 4 (floresan lokalizasyonunda değişim) olarak işaret modüle maddeler için tarama sağlar. Otomatik görüntü yakalama dramatik 5,6 kimyasal ekranların verimini artırır. Canlı Zebrafish otomatik tahlil floresan genellikle pahalı, özel ekipman güveniyor Ekranları. Sözde yüksek içerik tarama yüksek çözünürlük, sayısal görüntüleme ama konfokal mikroskopi 7,8 donanımlı özel plaka okuyucu kullanarak maliyetle yarar sağlar. Bu yöntemin amacı, zebra balığı embriyolar otomatik olarak analiz dokuya özel floresan etmektirStandart bir epifluorışıma mikroskobu kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde. Doku spesifik floresan bu tekniği kullanarak ayırt edilebilir ve özel plaka okuyucu veya yüksek içerik tarama donanımları ulaşamadıkları laboratuvarlar için makul bir yaklaşım olabilir. Bu protokol, biz 3 gün sonra döllenme (DPF) doku-spesifik östrojen reseptörü (ER) canlı zebrabalıkları agonistleri algılamak için otomatik görüntüleme kullanın. Transgenik satır Tg (5xERE: GFP) c262/c262 yeşil floresan protein (GFP) akış yukarı 5 tandem östrojen tepki elemanı DNA dizileri (ERE) içeren 3. Ligandın yokluğunda, ER normal olarak etkin değildir. Ligand bağlayıcı bir reseptör ERE DNA bağlama ve transkripsiyonu düzenleyen 9 sağlayan uygun bir değişiklik başlatır. 5xERE: GFP balık ER modülatörleri için kimyasal kütüphanelerinin taranması için kullanılabilir ve östrojenik kirletici maddeler için çevre su örnekleri taranması için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:885px;" width="886">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:451px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; wide bore</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; fine tip</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well, round, flat bottom plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 35mm paltes</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 60mm plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:100px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tricane methanesulfonate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040-25G</td>
			<td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629-10G</td>
			<td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &#956;M in E3B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x long working distance objective</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiocam HRm digital camera</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ZenBlue 2011 microscope control software</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;MB-1; 25 grams</td>
			<td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td>
		</tr>
		<tr height="273">
			<td height="273" style="height:273px;">E3B</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">60X E3 SOLUTION: 
			NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 17.2 grams 
			KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.76 grams 
			CaCl2-2H2O&#160;&#160;&#160;&#160; - 2.9 grams 
			MgSO4-7H2O&#160; - 4.9 grams or MgSO4 &#8211; 2.39 grams 
			Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 
			 
			1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 
			60X E3&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 150mls 
			2% methylene blue&#160;&#160;&#160;&#160; 100&#956;l&#160; 
			Bring to 9 liters with Milli-Q water 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

Zebrafish embriyolar küçük moleküllerin büyük ölçekli tarama için güçlü bir araçtır. Floresan haberci proteinleri eksprese eden transjenik zebra balığı sıkça, gen ekspresyonunu modüle eden kimyasal tanımlamak için kullanılır. Canlı Zebrafish floresan tahlil Kimyasal ekranlar genellikle yüksek içerik tarama için pahalı, özel ekipman güveniyor. Biz, bir motorlu kaide otomatik görüntü zebra balığı embriyolar için olan standart bir epifluorışıma mikroskop kullanılarak bir prosedür tarif ve dokuya özel floresan tespit eder. GFP ekspresyonu üzerinden östrojen reseptörü aktivitesi rapor transgenik zebrafish kullanarak, bir dokuya-özgü şekilde raportör aktif östrojen reseptör ligandları taranması için bir yarı-otomatik bir prosedür geliştirilmiştir. Bu videoda, 96 oyuklu bir plaka içerisinde 24-48 saat sonra döllenme (HPF) at zebra balığı embriyolar arraying ve östrojen reseptörlerine bağlanan küçük moleküller eklemek için işlemleri tarif eder. 72-96 hpf, her görüntüleri kuyudantüm plaka otomatik olarak toplanan ve el doku-spesifik floresan için denetlenmektedir. Bu protokol, ancak karaciğer, kalp valfleri reseptörlerinin aktive östrojen algılama yeteneği göstermektedir.

Şekil 1, bir 96 oyuklu plakanın her bir gözeneğinden bileşik görüntüleri gösterir. Her kompozit görüntü% 5 görüntü bindirme ile 59 ayrı görüntü oluşur. Canlı Zebrafish de her biri içinde rastgele odaklı, henüz biz karaciğer kalp floresan ayırt edebiliyoruz unutmayın. Zebra balığı aydınlık görsel yönünü belirlemek ve morfolojik anormallikleri (Şekil 1 A ve 1 C) görselleştirmek için referans olarak yararlıdır. 10x objektif kullanılarak otomatik g...

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Görüntüleme.  University of Alabama at Birmingham.  Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir. 

Video: Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biyoloji

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Küçük Kalpler Yarı-otomatik Optik Heartbeat Analizi

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Metabolik Etiketleme ve Bioorthogonal tıklayın Kimya Zebra balığı Embriyolar Görüntüleme glukanlardır

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...