Tavuk korrioallantoik membran üzerine tümörlerin engraftment, veya CAM, tümörijenite çalışmaları için kullanılabilir, tedavi etkinliği veya hücresel crosstalk. Bu yöntem, in vivo ayarında immüntoleransa dayanıklı bir tümör büyümesine izin verir. CAM modeli kullanılarak, yeni terapötik yaklaşımlar hızla hücre hatları ve hatta hasta tümör örnekleri kullanılarak test edilebilir.
Bu protokolün en önemli yönleri uygun CAM oluşumunu sağlamak ve yumurtaları açarken CAM veya vaskülatür bozmamaktır. Cam tam olarak geliştirildiğinde yedinci veya sekizinci gelişim gününde, yumurta rotatörükapatın ve biyogüvenlik kabininde yumurta rafına yaklaşık bir ila üç yumurta yerleştirin. Işıklar kapalı, tanımlamak ve bir yumurta hava hücresinin yerini işaretlemek için yumurta kabuğuna bir yumurta mum yerleştirin, sonra büyük bir kan damarı ağı bulmak için kabuk üzerinde yumurta mum hareket, gerektiği gibi yumurta dönen.
İdeal bir damar yumurtanın ortasına yakın dallanacak. İmplantasyon için kullanılacak vaskülatür izlemek için bir marker kullanın. Kaputun ışığını geri döndükten sonra, doğrudan hava hücresinin merkezi üzerinde kabuk küçük bir delik açmak için silikon karbür taş ile donatılmış bir akülü döner alet kullanın.
Kabuğun çoğu çıkarıldığında ancak beyaz iç zarı sağlam ken, vasküler pencerenin az önce gösterildiği gibi açılacağı küçük bir delik daha açın. İkinci delik hazır olduğunda, beyaz iç zarı hafifçe hava hücresi ve vaskülature üzerinde beyaz iç zarı delmek için 18 gauge iğne kullanın, ama CAM değil, delinmiş alanın tamamı boyunca bozulur dikkat. Kaput Unması ile, hava hücresinin yumurtanın ucundan damar üzerinde alana aktarıldığını doğrulamak için yumurta mumunu kullanın.
Gerekirse, orijinal hava hücresi üzerinde deliğin etrafına bir pipet denetleyicisine yerleştirilen vakum borularını yerleştirin ve hava hücresini hareket ettirebilmek için hafifçe kısa patlamalar halinde emme uygulayın. Hava hücresinin yeni yerinin ana hatlarını hava CAM sınırı içinde yaklaşık 0,5 santimetre olarak işaretleyin ve yeni hava hücresi üzerindeki deliği kapatacak kadar büyük bir ambalaj bandı parçasını düzeltin. Diğer iki yumurtayı az önce gösterildiği gibi hazırladıktan sonra yumurtaları kuvöze geri döndürün ve deney için 1-3 kişilik gruplar halinde ek yumurtaaçın.
Tüm yumurtalar açıldığında, bir biyogüvenlik kabininde yumurta rafına taşınan hava hücreleri ile bir ila üç yumurta aktarın ve CAM veya vaskülatür bozmadan hücre üzerinden tamamen hava hücresi sınırı üzerinde küçük bir çizgi kesmek için dairesel kesme tekerleği ile donatılmış bir akülü döner araç kullanın. Kavisli makas kullanarak, kabuk bir pencere oluşturmak ve embriyo canlılığını doğrulamak için kalan hava hücresi etrafında kesti. Canlı embriyolar geniş bir vaskülatür, berrak albumin, embriyo hareketi ve / veya görünür bir kalp atışı gösterecektir.
Cansız embriyolarda, CAM birkaç opak görünebilir, varsa, damarlar mevcut ve embriyolar küçük veya hareket veya kalp atışı olmadan yok olabilir. Semkin forceps kullanarak, steril bir pamuk topu küçük parçalar çekin ve yavaşça herhangi bir kabuk toz ve enkaz kaldırmak için canlı embriyoların CAM yüzeyi leke, sonra CAM dokunmadan altı yedi santimetre şeffaf film pansuman dörtte biri ile kabuk açılış kapağı ve açılan pencere yukarı bakacak şekilde kuvöz yumurta dönmek. Yumurta raf bir parça kullanın, yumurta rotator kenarı, ya da haddeleme tutmak herhangi bir yumurta prop için başka bir uygun öğe.
Transplantasyon için kanser hücresi süspansiyon hazırlamak için, ilgi kanser hücresi kültüründen hücreleri hasat ve santrifüj ile hücreleri tortu. Süpernatant aspire ve mekanik artık ortamda hücreleri resuspend. Hücre süspansiyonu buz üzerine yerleştirin ve orta hücre hacmini ölçmek için bir pipet kullanın.
Sonra orta 20 ila 100 mikrolitre mililitre ekstrasellüler matris başına 2,7 ila 4 miligram ve herhangi bir büyüme faktörleri veya ilgi diğer katkı maddeleri ile takviye bir ila iki milyon hücre konsantrasyonu hücreleri yeniden askıya. Kanser hücresi implantasyonu için, yapışmaz bir halka kullanarak, yumurta rafına yerleştirilecek altı yumurta yerleştirin ve şeffaf film pansumanının kenarlarını açık pencereye doğru yuvarlayın ve filmi kabuklardan çıkarın. Yumurtalar uygun ve sağlıklı olup olmadığını kontrol edin.
İdeal yumurta açılan alanın merkezinde küçük dallanma gemileri ile büyük bir gemi olacak. Kavisli iris forceps kullanarak, bir dal noktası üzerinde ideal gemi üzerinde CAM üzerine steril bir yapışmaz halka yerleştirin. Cam ve pipeti yavaşça halkanın ortasına kanser hücresi süspansiyon aşındırmak için steril bir cam karıştırma çubuğu kullanın.
Tüm hücreler teslim edildiğinde, açılışı altının dörtte biri ile yedi santimetre şeffaf film pansumanı ile kapatın ve yumurtayı uygun bir implant adı ile etiketleyin. Daha sonra yumurtaları kuvöze, kabuğun dik olarak açılmasıyla güvenli bir şekilde yerleştirin. Yapışmaz bir halka kullanmadan kanser hücrelerini yerleştirmek için, hücre süspansiyonuna uygun büyüklükte bir pipet ucuna aspire edin ve ucun üst kısmını dikkatlice pipet ucunu dışarı tutarak ve ucu yatay olarak steril 10 santimetrelik doku kültür yemeğine yerleştirin.
İpuçları yüklendikten sonra, 15 dakika sonra polimerizasyon için kontrol, 15 ila 30 dakika boyunca 37 derece santigrat santigrat kuvöz içine çanak yerleştirin. Her ucu çanak yerleştirilir gibi sıvı küçük bir miktar genellikle dışarı sızıntı olacaktır. Uç içindeki polimerizasyonun kapsamını tahmin etmek için bu sıvıyı kullanın.
Matris hazır olduğunda, uygun büyüklükteki bir pipete bir ucu yerleştirin ve kısmen polimerize hücre süspansiyonu cam üzerine ideal büyük bir iyi gelişmiş geminin dallı noktası üzerinde zorlamak için piston depress. Bu yöntemler kullanılarak, hem insan hem de ürinen yumurtalık kanseri hücre hatları ve primer tümör parçaları, diğer in vivo modellerde gözlenen morfolojilerle uyumlu tümörlerin başarılı bir şekilde engreftleştirilen sonuçlanmıştır. Test edilen tümör tipleri, yumurtalık kanseri büyüme çok daha az belirgin ve genellikle biyolüminesans görüntüleme yardımı olmadan görünür değildi.
İmplantasyon sırasında büyüme faktörleri veya hormonekleme etkileri de bu yöntemler kullanılarak test edilebilir. Böbrek kanseri için, kurulan hücre hatları veya primer insan böbrek tümörlerinden parçalardan berrak hücreli renal hücreli karsinom hücrelerinin implantasyonu hızlı, sağlam tümör oluşumu üretir. Ayrıca, birden fazla insan ve murin prostat kanseri hücre hatları ve insan mesane kanseri hücre hatları ve primer tümör parçaları bu modeli kullanarak tümörler kurmak için kullanılmıştır.
CAM'i ve vaskülatürü bozmamak ve camın pencereyi açarken kabukla yapışmadığından emin olmak çok önemlidir. Başarılı engraftment sonra, CAM modeli bir tümör içinde farklı hücre tipleri arasında ilgi veya etkileşim tedavilerin terapötik etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.
