Присвоение опухолей на куриной хориоаллантической мембране, или CAM, может быть использовано для исследования опухолевых, эффективность лечения или клеточного перекрестного разговор. Этот метод позволяет экономически эффективный быстрый рост опухоли в иммунотолерантных in vivo настройки. Используя модель CAM, новые терапевтические подходы могут быть быстро протестированы с использованием клеточных линий или даже образцов опухоли пациента.
Наиболее важными аспектами этого протокола являются обеспечение надлежащего формирования CAM и не нарушая CAM или сосуды при открытии яйца. На день развития семь или восемь, когда CAM полностью разработаны, выключите яйцо ротатор и место примерно от одного до трех яиц в яйцо стойку в биобезопасности кабинета. С выключенным светом, поместите яйцо свечи против яичной скорлупы, чтобы определить и отметить расположение воздушной клетки одного яйца, а затем переместить яйцо свечи над оболочкой, чтобы найти большую сеть кровеносных сосудов, вращая яйцо по мере необходимости.
Идеальная сосудоугольница будет ветвиться ближе к середине яйца. Используйте маркер для отслеживания сосудов, которые будут использоваться для имплантации. После поворота назад на свет в капюшоне, используйте беспроводной роторный инструмент, оснащенный кремниевым карбидом шлифовальный камень, чтобы просверлить небольшое отверстие в оболочке непосредственно над центром воздушной ячейки.
Когда большая часть оболочки была удалена, но с белой внутренней мембраны нетронутыми, сверлить еще одно небольшое отверстие, где сосудистое окно будет открыто, как только что продемонстрировано. Когда второе отверстие будет готово, используйте 18 калибровочной иглы, чтобы мягко проколоть белую внутреннюю мембрану над воздушной клеткой и сосуды заботясь о том, что белая внутренняя мембрана, но не CAM, нарушается по всей пробуреной области. С капотом свет снова, использовать яйцо свечи, чтобы убедиться, что воздушная клетка была передана из конца яйца в область над сосудами.
При необходимости поместите вакуумные трубки, вставленные в контроллер пипетки вокруг отверстия над исходной воздушной ячейкой, и аккуратно нанесите всасывание короткими очередями для перемещения воздушной ячейки. Отметьте контур нового расположения воздушной ячейки примерно на 0,5 сантиметра внутри границы воздушного CAM и зафиксните кусок упаковочной ленты достаточно большим, чтобы покрыть отверстие над новой воздушной ячейкой. После подготовки двух других яиц, как только что продемонстрировано, вернуть яйца в инкубатор и открыть любые дополнительные яйца для эксперимента в группах от одного до трех, как попродемонстрировано.
Когда все яйца были открыты, передать от одного до трех яиц с перемещены воздушные клетки на яйцо стойку в биобезопасности шкаф и использовать беспроводной роторный инструмент, оснащенный круговой резки колесо сократить небольшую линию над границей воздушной ячейки полностью через клетку, не нарушая CAM или сосудов. Используя изогнутые ножницы, разрежьте оставшуюся воздушную клетку, чтобы создать окно в оболочке и проверить жизнеспособность эмбриона. Жизнеспособные эмбрионы будут отображать обширную сосудику, четкий альбумин, движение эмбриона, и / или видимое сердцебиение.
В незвуких эмбрионах CAM может показаться непрозрачным с несколькими, если таковые имеются, сосудами, присутствующими и эмбрионы могут быть маленькими или отсутствующими без движения или сердцебиения. Используя типсы Semkin, вытяните маленькие кусочки хлопка из стерильного ватного шарика и аккуратно промоките поверхность CAM жизнеспособных эмбрионов, чтобы удалить любую пыль и мусор оболочки, затем накройте отверстие оболочки четвертью шести на семь сантиметров прозрачной пленкой, не касаясь CAM, и верните яйца в инкубатор с открытым окном вверх. Используйте кусок яичной стойки, край яйца ротатор, или другой подходящий пункт, чтобы поддержать любые яйца, которые держат прокатки.
Для подготовки подвески раковых клеток для трансплантации, урожай клеток из культуры раковых клеток, представляющих интерес и осадок клеток центрифугации. Аспиратировать супернатант и механически повторное течение клеток в остаточной среде. Поместите подвеску клетки на лед и используйте пипетки для измерения объема клеток в среде.
Затем повторно посовестить клетки в концентрации от одного до двух миллионов клеток в 20 до 100 микролитров среднего дополняется от 2,7 до 4 миллиграммов на миллилитр внеклеточной матрицы и любые факторы роста или другие добавки, представляющие интерес. Для имплантации раковых клеток, используя антипригарное кольцо, поместите до шести яиц, которые будут имплантированы на стойку яйца и свернуть края прозрачной пленки соусом к открытому окну, чтобы удалить пленку из оболочек. Проверьте, являются ли яйца жизнеспособными и здоровыми.
Идеальные яйца будут иметь большой сосуд с меньшими ветвясь судов в центре открытой области. Используя изогнутые типсы радужной оболочки глаза, поместите стерильное антипригарное кольцо на CAM над сосудом идеально над точкой ветви. Используйте стерильный стеклянный стержень перемешать, чтобы мягко абрадировать CAM и пипетки подвески раковых клеток в центре кольца.
Когда все клетки были доставлены, печать открытия с одной четверти кусок шесть на семь сантиметров прозрачной пленки соусом и этикетки яйцо с соответствующим обозначением имплантата. Затем поместите яйца надежно в инкубатор с открытием оболочки лицом вертикально. Для имплантации раковых клеток без использования антипригарного кольца, аспирировать клеточной подвески в соответствующим размером кончик пипетки и проведение верхней части кончика тщательно извлечь кончик пипетки и поместить кончик горизонтально в стерильные 10 сантиметров ткани культуры блюдо.
После того, как кончики были загружены, поместите блюдо в 37 градусов по Цельсию инкубатор в течение 15 до 30 минут, проверка на полимеризацию через 15 минут. Небольшое количество жидкости, как правило, утечка, как каждый совет помещается в блюдо. Используйте эту жидкость для оценки степени полимеризации в кончике.
Когда матрица будет готова, поместите один наконечник на пипетку соответствующего размера и угнетаете поршень, чтобы заставить частично полимеризованную подвеску клетки на CAM идеально над разветвленной точкой большого хорошо развитого сосуда. Используя эти методы, как человеческие, так и муринные линии раковых клеток яичников и первичные опухолевые части привели к успешному присвоевременности опухолей морфологиями, которые наблюдаются в других моделях in vivo. Из проверенных типов опухолей рост рака яичников был гораздо менее выраженным и, как правило, не видимым без помощи биолюминесценции изображения.
Эффекты добавления факторов роста или гормонов во время имплантации также могут быть проверены с помощью этих методов. При раке почек имплантация клеток карциномы почек из установленных клеточных линий или частей первичных опухолей почек человека приводит к быстрому, надежному образованию опухолей. Кроме того, несколько человеческих и murine рака предстательной железы клеточных линий и человеческих линий раковых клеток мочевого пузыря и первичных опухолей штук были использованы для создания опухолей с помощью этой модели.
Очень важно, чтобы избежать нарушения CAM и сосудов и убедиться, что CAM не прилипает к оболочке при открытии окна. После успешного engraftment, модель CAM может быть использована для оценки терапевтической эффективности лечения интересов или взаимодействия между различными типами клеток в опухоли.
