L'innesto di tumori sulla membrana corioallantoica del pollo, o CAM, può essere utilizzato per studi di tumorigenicità, efficacia del trattamento o crosstalk cellulare. Questo metodo consente una rapida crescita del tumore in un ambiente immunotollerante in vivo. Utilizzando il modello CAM, nuovi approcci terapeutici possono essere rapidamente testati utilizzando linee cellulari o persino campioni di tumore del paziente.
Gli aspetti più cruciali di questo protocollo sono garantire una corretta formazione CAM e non interrompere il CAM o la vascucolatura durante l'apertura delle uova. Il giorno di sviluppo sette o otto quando il CAM si è completamente sviluppato, spegnere il rotatore dell'uovo e posizionare circa una o tre uova nel portaovo nell'armadietto della biosicurezza. Con le luci spente, posizionare un candelabro d'uovo contro il guscio d'uovo per identificare e contrassegnare la posizione della cellula d'aria di un uovo, quindi spostare il candeliere dell'uovo sul guscio per trovare una grande rete di vasi sanguigni, ruotando l'uovo se necessario.
Una vascucolatura ideale si ramifica vicino al centro dell'uovo. Utilizzare un marcatore per tracciare la vascu caratteristica da utilizzare per l'impianto. Dopo aver riacceto la luce nel cofano, utilizzare uno strumento rotativo cordless dotato di una pietra di rettifica in carburo di silicio per praticare un piccolo foro nel guscio direttamente sopra il centro della cella d'aria.
Quando la maggior parte del guscio è stata rimossa ma con la membrana interna bianca intatta, praticare un altro piccolo foro in cui verrà aperta la finestra vascolare come appena dimostrato. Quando il secondo foro è pronto, utilizzare un ago calibro 18 per perforare delicatamente la membrana interna bianca sopra la cella d'aria e la vascucolatura facendo attenzione che la membrana interna bianca, ma non il CAM, sia interrotta in tutta l'area forata. Con il cappuccio di nuovo spento, utilizzare il candeliere dell'uovo per verificare che la cellula dell'aria sia stata trasferita dall'estremità dell'uovo all'area sopra la vascucolatura.
Se necessario, posizionare i tubi sottovuoto inseriti in un controller di pipetta attorno al foro sopra la cella d'aria originale e applicare delicatamente l'aspirazione in brevi raffiche per spostare la cella d'aria. Contrassegnare il contorno della nuova posizione della cella d'aria di circa 0,5 centimetri all'interno del limite CAM dell'aria e fissare un pezzo di nastro di imballaggio abbastanza grande da coprire il foro sopra la nuova cella d'aria. Dopo aver preparato le altre due uova come appena dimostrato, riportare le uova nell'incubatrice e aprire eventuali uova aggiuntive per l'esperimento in gruppi da uno a tre come dimostrato.
Una volta aperte tutte le uova, trasferire da una a tre uova con celle d'aria ricollocate al portaovo in un armadio per la biosicurezza e utilizzare uno strumento rotativo cordless dotato di una ruota di taglio circolare per tagliare una piccola linea oltre il confine della cellula d'aria completamente attraverso la cella senza interrompere il CAM o la vascucolatura. Utilizzando forbici curve, tagliare intorno alla cella d'aria rimanente per creare una finestra nel guscio e verificare la vitalità dell'embrione. Embrioni vitali mostrerà una vascucolatura estesa, un'albumina chiara, un movimento embrionale e / o un battito cardiaco visibile.
Negli embrioni non praticabili, il CAM può apparire opaco con pochi, se non nessuno, vasi presenti e gli embrioni possono essere piccoli o assenti senza movimento o battito cardiaco. Utilizzando le forcep Semkin, estrarre piccoli pezzi di cotone da un batuffolo di cotone sterile e tamponare delicatamente la superficie CAM degli embrioni vitali per rimuovere polvere e detriti del guscio, quindi coprire l'apertura del guscio con un pezzo di un quarto di pellicola trasparente di sei per sette centimetri che si veste senza toccare il CAM e riportare le uova nell'incubatrice con la finestra aperta rivolta verso l'alto. Usa un pezzo di cremagliera per uova, il bordo del rotatore dell'uovo o un altro oggetto adatto per puntellare le uova che continuano a rotolare.
Per preparare la sospensione delle cellule tumorali per il trapianto, raccogliere le cellule dalla coltura cellulare tumorale di interesse e sedimentare le cellule mediante centrifugazione. Aspirare il supernatante e rimescolare meccanicamente le cellule nel mezzo residuo. Posizionare la sospensione cellulare sul ghiaccio e utilizzare una pipetta per misurare il volume delle cellule in mezzo.
Quindi rimostrare le cellule ad una concentrazione da una a due milioni di cellule in 20-100 microlitri di mezzo integrati con matrice extracellulare da 2,7 a 4 milligrammi per millilitro e qualsiasi fattori di crescita o altri additivi di interesse. Per l'impianto di cellule tumorali, utilizzando un anello antiaderente, posizionare fino a sei uova da impiantare sul rack delle uova e arrotolare i bordi della pellicola trasparente che si veste verso la finestra aperta per rimuovere il film dai gusci. Controlla se le uova sono vitali e sane.
Le uova ideali avranno una grande nave con vasi ramificati più piccoli all'interno del centro dell'area aperta. Utilizzando le forcep del diaframma curve, posizionare un anello sterile antiaderente sul CAM sopra il recipiente idealmente su un punto di diramazione. Utilizzare un'asta di agitazione in vetro sterile per abrasare delicatamente il CAM e pipettare la sospensione della cellula tumorale al centro dell'anello.
Una volta che tutte le cellule sono state consegnate, sigillare l'apertura con un pezzo di un quarto di pellicola trasparente di sei per sette centimetri ed etichettare l'uovo con un'appropriata designazione implantare. Quindi posizionare le uova saldamente nell'incubatrice con l'apertura del guscio rivolto verso l'alto. Per impiantare le cellule tumorali senza l'uso di un anello antiaderente, aspirare la sospensione cellulare in una punta di pipetta di dimensioni appropriata e tenere la parte superiore della punta espellere con cura la punta della pipetta e posizionare la punta orizzontalmente in un piatto sterile di coltura tissutale di 10 centimetri.
Dopo aver caricato le punte, posizionare il piatto in un incubatore di 37 gradi Celsius per 15-30 minuti, controllando la polimerizzazione dopo 15 minuti. Una piccola quantità di liquido in genere fuoriescono quando ogni punta viene posizionata nel piatto. Utilizzare questo liquido per stimare l'estensione della polimerizzazione all'interno della punta.
Quando la matrice è pronta, posizionare una punta su una pipetta di dimensioni appropriata e deprimere lo stantuffo per forzare la sospensione cellulare parzialmente polimerizzata sul CAM idealmente sopra il punto ramificato di un grande contenitore ben sviluppato. Utilizzando questi metodi, sia le linee cellulari tumorali ovariane umane che murine e i pezzi tumorali primari hanno portato al successo dell'innesto dei tumori con morfologie coerenti con quelle osservate in altri modelli in vivo. Tra i tipi di tumore testati, la crescita del cancro alle ovaie era molto meno pronunciata e tipicamente non visibile senza l'assistenza dell'imaging a bioluminescenza.
Gli effetti dell'aggiunta di fattori di crescita o ormoni al momento dell'impianto possono anche essere testati utilizzando questi metodi. Per il cancro ai reni, l'impianto di cellule carcinoma a cellule renali a cellule chiare da linee cellulari consolidate o pezzi di tumori renali umani primari produce una formazione tumorale rapida e robusta. Inoltre, per stabilire i tumori utilizzando questo modello erano state utilizzate molteplici linee cellulari tumorali della prostata umana e murina e linee cellulari tumorali della vescica umana e pezzi tumorali primari.
È fondamentale evitare di interrompere il CAM e la vascucolatura e assicurarsi che il CAM non aderisca al guscio durante l'apertura della finestra. Dopo un accinnesto riuscito, il modello CAM può essere utilizzato per valutare l'efficacia terapeutica dei trattamenti di interesse o delle interazioni tra diversi tipi di cellule all'interno di un tumore.
