Membran proteinlerinin çalışmaları için çıkarıldığı klasik yöntem deterjanda basit çözünürasyondur. Bu basit ve evrensel bir yöntem sağlarken, deterjanların bu hassas proteinlerin doğal yapısını, işlevini ve aktivitesini değiştirdiği gösterilmiştir. Burada peptidiski deterjansız çözeltide membran proteinlerini stabilize etmek için bir çözüm olarak sıyoruz.
Peptidisk sistemi sayısız membran proteininin büyüklüğüne, şekline ve tipolojisine kendiliğinden uyum sağlar. Bu genellikle sıkıcı optimizasyon gerektiren diğer membran mimetikaksine duruyor. FhuA, bir E.coli dış membran proteini, bu protokolde yeniden oluşturulacak bir model hedef protein olarak kullanılacaktır.
Dış membran vezikülleri izole edilecek ve ardından membran proteinlerini solubilize etmek için deterjan ilave edilecektir. Peptidisk peptid çözünürasyon eklenir ve deterjan uzak seyreltilir, kendiliğinden Peptidisk parçacıkları oluşturan. Bu stabilize çözünür parçacıklar artık çok sayıda downstream uygulamaları için uygun.
Bu protokol, peptid teknolojisinin bir uygulaması olarak biyo-tabaka interferometrisini inceleyecektir. Bu protokol, membran proteinlerinin eşzamanlı saflaştırılmasını ve yeniden yapılandırılmasını kolaylaştıran yararlı bir teknik olan PeptiQuick yeniden yapılanma yöntemine odaklanacaktır. On-boncuk reconstitution PeptiQuick yöntemi standart bir Nikel-NTA IMAC yerçekimi sütunönceden deterjan dengelenen gerçekleştirilir.
Çözünür membran rezorin üzerine yüklenir ve hedef olmayan proteinler yıkanır. Bu peptid kolona eklendikten sonra deterjan hızla seyreltilir. Peptidisk peptid hidrofobik tarafı maruz hidrofobik bölgeler ile ilişkilendirir.
Peptidin hidrofilik tarafı çözeltide proteini çözünür tutar. Aşırı peptid yıkanır. Imidazol yeniden oluşturulan öfke yiyebilmek için eklenir.
Peptidisk iskeledolaylı olarak bellek proteinlerini etiketlemek ve böylece daha geniş bir downstream analizleri kümesine kapıyı açmak için işlevselhale getirilebilir. Burada BLI analizi için streptavidin kaplı sensörlere bağlanmak için biyotinylated peptid yararlanmak. Biyo-tabaka interferometri, çözeltideki biyomoleküler etkileşimleri araştırmak için güçlü bir etiketsiz tekniktir.
Bu teknik, sadece etkileşimleri göstermenin yanı sıra, gerçek zamanlı kinetik bir okuma sağlar ve bağlayıcı bir dissosilasyon sabitinin hesaplanmasını sağlar. Bu protokol sayesinde, BLI analizi sırasında deterjan ihtiyacını ortadan kaldırıyoruz, çünkü bu aktiviteyi değiştirebilir. Biyolayer interferometri, sensörden veya uçtan yansıyan beyaz ışığın ve bir etkileşim sırasında bağlı makro moleküllerin infilak eden parazitini analiz eder.
Etkileşimleri ölçmek için, duyu ucu çözümler ve her adımda kaydedilen sinyal arasında geçirilir. Her ipucu daha sonra bir sensogram üzerinde kendi iz verir. İlk olarak, yalnızca arabellek bir taban çizgisi oluşturulur.
İkincisi, ligand bağlı. Bu durumda, FhuA ve biyotinylated Peptidiscs bir streptavidin kaplı ucu bağlar. Daha sonra, uç herhangi bir bağlanmamış FhuA kaldırmak için tampon yıkanır.
Şimdi ucu analit bilinen bir konsantrasyon ile bir çözüm içine taşınır, burada ColM. Bir etkileşim oluşursa, bu bağlayıcı bir eğri verecektir. Son olarak, uç arabelleğe taşınır ve dissociation ölçülür.
Her kolon konsantrasyonunda ilişki ve ayrışma için gözlenen oranlar ayrışma sabitini hesaplamak için kullanılabilir. Heksahistidin etiketli FhuA amin ortamda 18 saat boyunca E-coli suşu AW740 ifade edilir. Bakteriler 5, 000 G'nin 10 dakikası 4 santigrat derecede santrifüjle hasat edilir.
Ortaya çıkan hücre pelett tsg tampon yeniden askıya alınır ve daha sonra hücresel kümeleri kırmak ve iyice lysis sağlamak için dounced. TMSF, yeniden askıya alınan hücrelere, lysis'ten hemen önce bir milimolar konsantrasyonuna eklenir. Hücre lizisi, 15, 000 PSI'da bir mikroakışkanveya 8,000 PSI'da bir Fransız presi ile üç pasaj la elde edilir.
Lysed hücreleri toplanır ve 4 derecede 10 dakika boyunca 5, 000 G'de düşük hızlı santrifüj yapılır. Yavaş hızlı spin bir supernatant bir TI70 ultracentrifuge rotor içine yüklenir ve 200, 000 G's 40 dakika dört derece ham E.coli membran pelet için santrifüj. Ultrasantrifüjden sonra, supernatant atılır ve ham membran pelet TSG tampon en az miktarda yeniden askıya alınır.
Homojenliğini sağlamak için ham bir zar dounceedilir. Bir Bradford Assay yeniden askıya ham membran protein konsantrasyonu kontrol etmek için yapılır. TSG tamponu, ham membranı solubilizasyondan önce mililitre başına yaklaşık üç miligrama seyreltmek için kullanılır.
Triton X-100 seçici bakteriyel iç membran ı sindürmek için% 1 son konsantrasyonda yeniden askıya ham membran eklenir. Solubilizasyon dört derece bir saat için, nazik sallanan ile gerçekleştirilir. Çözünmemiş dış zar 200, 000 G'de 40 dakika, 4 derece ultrasantrifüj ile izole edilir.
Çözünür iç zarı içeren ortaya çıkan supernatant atılır. Dış zarı içeren pelet, TSG'de eskisi gibi yeniden askıya alınır. LDAO yeniden askıda dış membran% 1 son konsantrasyoneklenir, ve dört derece bir saat için solubilize.
Son olarak, bir ultrasantrifüj yapılır, daha önce olduğu gibi, pelet çözünmez malzeme. Ortaya çıkan supernatant, hedef, onun etiketli FhuA, şimdi eşzamanlı IMAC arıtma ve Peptidisc reconstitution için hazır da dahil olmak üzere çözünürdış membran içerir. Nikel-NTA IMAC yerçekimi sütunu, iki sütun hacmi IMAC yıkama arabelleği ile önceden dengelenir.
İzidazol, %0.04 LDAO'ya seyreltilmiş, çözünür dış zarına beş milimolar son konsantrasyonda eklenir. Çözünür dış membran Nikel-NTA rezorna yüklenir ve toplanan akış. FhuA'nın rezorin bağlanmasını artırmak için bu akış rezorin üzerine yeniden yüklenir.
Yüklemeden sonra, reçin 250 mililitre IMAC yıkama tamponu ile yıkanır ve ilk 50 mililitre toplanır. Yıkandıktan sonra, yıkama tamponu reçine yatağının yüksekliğinin hemen üstüne boşaltılır ve kolon stopcock kapatılır. Bir mililitre konsantre, mililitre de 10 miligram, Kolonun ait peptidisk peptidi eklenir.
Konsantre peptid eklenmesinden sonra, 50 mililitre seyreltik, mililitre başına bir miligram, TSG peptid peptid eklenir. Rezorin, boncukları TSG'ye yeniden askıya almak için karıştırılır, LDAO CMC'sinin altında, böylece Peptidisk parçacıkları oluşturur. Peptidisk bindirme sonra, rezorin yerleşmek için izin verilir ve mililitre peptid çözeltisi başına bir miligram rezorin ile boşaltılır.
Reçine fazla Peptid peptid kaldırmak için 50 mililitre TSG ile yıkanır. Son olarak, Peptidisk parçacıklar TSG 600 milimolar imidazol 50 mililitre ile seyreltilir. Bir mililitre fraksiyonları toplanır ve 0.5 molar EDTA 10 mikrolitre eklenir, önemli bir ışık leached nikel iyonları.
Başlangıç, akış, yıkama ve kaçan fraksiyonları% 12 SDS jel üzerine yüklenir ve 60 miliamper 30 dakika elektroforrezed. Jel lekeli ve bir jel tarayıcı üzerinde görselleştirilmiş. Ortaya çıkan jel akış fhuA tükenmesi gösterir, ve elüsasyon zenginleştirme.
Küçük kirletici bantlar da eluded fraksiyonları gözlenir. FhuA Peptidisk çözünürlüğünü doğrulamak ve kirleticileri tüketmek için boyut dışlama kromatografisi için üçten 7'ye kadar kesirler seçilir. 30 Kilodome kesilmiş santrifüj konsantratörü kesirleri üçten 7'ye konsantre etmek için kullanılır.
Bir mililitre havuzlu IMAC elusion fraksiyonları TSG tamponunda dakikada 0,25 mililitre akış hızında S200 sütununa enjekte edilir. Bir mililitre kesir toplanır ve kesirlerin %12'lik SDS jeli çalıştırılır. İlgili kesirler bir araya gelir ve artık akış aşağı uygulamalarında kullanılabilir.
BLI forteBio Octet RED96'da yapılmıştır. Bu alet, BLI pimlerini ilk olarak elle kurulan 96 kuyuluk plakası boyunca hareket ettirir. Tüm kuyular 200 mikrolitrelik son bir hacme kadar doldurulur.
Sütun bir ipuçları equilibrate ve bir temel sinyal oluşturmak için izin vermek için kinetik arabellek ile yüklenir. Sütun iki ligand ve kinetik tampon önceden belirlenmiş bir konsantrasyon ile yüklenir. Bu durumda, FhuA ligand, ve mililitre başına 2.5 mikrogram konsantrasyonu eklenir.
E satırındaki uç başvuru olarak kullanılır ve yalnızca arabellek ile yüklenir. Sütun üç uçtan fazla FhuA yıkamak için kinetik tampon ile yüklenir. Analyt iki kat seri seyreltme, bu durumda ColM, sütun dört yukarıdan aşağıya yüklenir.
Bu konsantrasyonların en yüksek noktası, analitin uca spesifik olmayan bağlanmasını ölçmek için referans satırı için kullanılır. Sütun beş arabellek ile yüklenir. Burada, ColM ayrışacak ve ayrışma ölçülecek.
Plaka hazırlandıktan sonra sensör-uç tepsisi ve hazırlanan plaka BLI aletine yüklenir. BLI veri toplama yazılımı açıldı ve yeni bir kinetik deneme başlatıldı. Plaka Tanımı sekmesi, 96 kuyulu plakanın düzenini yazılıma girmek için kullanılır.
Burada ligand FhuA yük olarak giriş, analit ColM ise örnek olarak giriş yapılır. Denemedeki her adım için zaman ve plaka döndürme hızının uzunluğunu tanımlamak için Assay Tanımı sekmesi kullanılır. Burada 60 saniyelik bir temel adım, ardından 250 saniyelik bir yükleme adımı, 300 saniyelik ikinci bir temel adım, 450 saniyelik bir analiz ilişkilendirme adımı ve son olarak 900 saniyelik bir ayrışma adımı yer alıyoruz.
Bu adımlar, istenen adımı seçerek ve her sütunda Teşrin ekle'ye sağ tıklayarak 96 kuyulu plakadaki her sütuna ayrı ayrı atanır. Sensör atama sekmesi, Oktetik aletin sensör tepsisindeki doğru konumdan BLI pimleri aldığını sağlamak için kullanılır. Denemeyi Gözden Geçirme sekmesi, yürütmeden önce denemenin son genel görünümünü sağlar.
BLI şimdi Octet RED tarafından yürütülecektir. Bu analiz için ham veri sensogram üretecektir. Analiz ilk Octet biyoveri analiz yazılımı açılarak gerçekleştirilir.
Veri Seçimi sekmesi, denemeyi bulmak ve deneme özetini denetlemek için kullanılır. Analyte ColM konsantrasyonları burada girdi. Daha sonra, İşlem sekmesi, deneme verilerinden referans sinyalini çıkarmak için kullanılır.
Taban çizgisi, Y eksenini alaşımdan arındırır hızı uygulanmış gibi hizalamak için tanımlanır. Son olarak, İşlem Verileri seçilir. Veriler bu deneme için yalıtılır ve Fit Eğrileri seçilir.
Kısmi bir ilişkilendirme ve ayrışma eğrisi uydurma seçilir. Kd bu montaj hesaplanır. Boyut dışlama kromatogram ambute reconstitution doğrulamak için kullanılır.
Kromatogram tek bir simetrik tepe gösterir, bir monodisperse protein hazırlanması düşündürmektedir. Tepe, boş hacimden sonra birkaç mililitre yiyerek biraraya gelen çözünür Peptid partiküllerini gösterir. Protein agregaları boşluk hacminde, aşırı deterjanlar ve peptid ana tepeyi takip eden eter olacaktır.
Hala Nikel-NTA boncuk bağlı iken oluşan Peptidiskler artan yıkama bu ikinci tepe tüketmek gerekir. Protein agregaları genellikle hafıza proteinlerinin yeniden yapılanma dan önce deterjansız çözeltiye maruz kalmalarının bir sonucudür. Bu son dışlama kromatogramı, kişinin yeniden yapılandırılmasında sorun giderme için yararlı bir tanıyöntemidir.
Deneysel verilerin işlenmesinden sonra, sensograma bir eğri sığar. Bu montajDoğruluğu dissociation sabitinin hesaplanması için gereklidir. Artık görünüm çizimi, deney verileri ile hesaplamalı montaj arasındaki farkı açıklar.
Bu, dört farklı sütun konsantrasyonu için eğrilerden üçünün iyi uyduğunu gösterir. Ancak, en yüksek konsantrasyon için eğri iyi bir uyum üretmez. Bu, bu yüksek konsantrasyonda, pin sütunheterojen bağlama olduğunu göstermektedir.
Bu nedenle, forteBio uygulama notları uyarınca bu yüksek konsantrasyon sinyali kinetik analizden dahil edilmez. Kalan üç eğrik analizi için kullanılır. BLI ve Peptidisc yöntemi kullanılarak belirlenen FhuA ve ColM arasındaki ayrışma sabiti, diğer yöntemlerle belirlenen sabitlerle tutarlıdır.
Izothermal kalorimetre ve nanodiskler, mikro ölçekli termforeve Peptidisk bizim belirlenen değerden önemli ölçüde farklı olmayan ayrışma sabitleri vermiştir. Bu tutarlılık etkileşim kinetik ölçmek için Peptidisc BLI yöntemidoğrular. Pekâlâ, bu videoyu izledikten sonra, PeptiQuick yöntemlerinin gücü ve ihtarını pratik olarak anladığınızı umuyoruz.
Bu yöntemi özellikle deterjanların yokluğunda FhuA ColM etkileşimini ölçmek için yararlı bulduk. Ve aynı iş akışının başka bir reseptör-ligand etkileşimini karakterize etmek için de uygulanabileceğinden şüpheleniyoruz. Deneylerinizde iyi şanslar.
