Bu protokolde açıklanan izleme tekniği nöronal morfogenezi çalışmamıza ve Drosophila'nın motor nöron sistemindeki bağlantıyı yakalamamıza yardımcı olur. Lipophilic boya hızla son derece yüksek yoğunluklu hücre zarının her parçasına yayılabilir. Bu nedenle protokolümüz etiketli bir nöronun yapılarını bulmaya etkin bir şekilde karar verir.
Bir akson terminali enjeksiyon mikropipeti ile erişilebilir ise, bu teknik sinekler veya diğer organizmaların larva ve yetişkin aşamalarında herhangi bir nörona uygulanabilir. Numune üzerinde mikroenjektör hassas bir işlem izleme veya kullanma konusunda hiç deneyiminiz yoksa, zor layıcı olabilir. Embriyo anatomisi anlamak, diseksiyon veya dinjection yürütmek için araçların uygun porsiyonrehberlik ile yardımcı olacaktır.
Başlamak için, hazırlamak ve düzen tüm embriyo toplama malzemeleri. 50 mililitrelik bir tüpü keserek ve kapakta bir delik açarak filtrasyon aparatını hazırlayın. Daha sonra tüp ve kapak arasında 100 mikrometre gözenekile bir örgü filtre ayarlayın.
1.2 milimetre iç çapı ile aynı kılcal boru boya enjeksiyon mikropipet ve diseksiyon iğnesi hazırlayın. Bir mikropipet ile tüp çekin, puller 7% 170 volt maksimum çıkış uzunluğu yaklaşık 0,4 santimetre konik ile keskin bir iğne oluşturmak için. Boya enjeksiyonu mikropipetini hazırlamak için öğütücüye Bir ıslatma maddesi ile ıslatın ve iğneyi 25 ila 30 derece mikropipet kelepçesine yerleştirin.
Daha sonra ucu yarıçapın üçte ikisine indirin. İğneyi öğütün, tüplü bir şırınga havayı içine iter. Bir açıda oluşan dar açıklığı bulmak zor olabilir, çünkü beveling sonra ucunda ki açılış konumunu belirtmek için ince bir ucu kalıcı marker ile mikropipet işaretleyin.
Sinekler oda sıcaklığında bir gecede yumurtlamak ve sabah yumurta ile boru toplamak için izin verin. Embriyoları toplamak için, beş dakika boyunca% 50 çamaşır suyu ile plaka üzerinde yumurta deklorinat. Kloriyonlar temizlendikten sonra, embriyoları izole etmek için plakanın içeriğini filtrasyon aparatı veya hücre süzgecinden geçirin.
Plaka üzerinde bırakılan çamaşır suyunu seyreltmek için bir şişe su kullanın ve karışımı filtreye ayırarak mümkün olduğunca çok embriyo toplayın. Çamaşır suyu kokusu dağılına kadar embriyoları 3-4 kez suyla yıkayın. Filtreyi cihazdan çıkarın ve su yla birlikte başka bir temiz tabağa yıkayın.
Sonra da embriyoların üzerinde olduğu yeni plakadan suyu çıkar. Yumurtlamadan 15 saat sonra 5-10 embriyo seçmek için ince çökezleçler kullanın ve sırt tarafı yukarı bakacak şekilde çift taraflı bant üzerine yerleştirin. Desiccation gelen embriyoları korumak için diseksiyon havuzuna böcek zil salin ekleyin.
Embriyoyu banttan cam üzerine çıkarmak için bir diseksiyon mikroskobu altında cam iğne kullanın, embriyonun iç dokularına zarar vermemeye özen. Sonra tek bir embriyonun orta çizgisini arka yüzeyinden ön uca doğru kesin. Epitel dokuları merkezden çevirin ve epidermal kenarı cam kaydıraktan yüzeye takın.
Dorsal uzunlamasına trakeal gövdeleri yanı sıra kalan bağırsakları kaldırmak için hava aspire veya üfleme için yaklaşık 300 mikrometre bir ucu açılış ile bir tüp bağlı iğne kullanın. Bir orbital shaker üzerinde oda sıcaklığında beş dakika embriyoları düzeltmek için% 4 PFA ve PBS kullanın. Sonra PBS ile üç kez yıkayın.
Embriyoları bir mikrolitre anti horseradish peroksidaz antikorile lekelayın. PBS'deki yıkıntıları tekrarlayın. Enjeksiyon mikropipetini doldurmak için kılcal damar tutucuya yerleştirin.
Sonraki yere sahneye boya slayt ve slayt üzerinde konumlandırmak için mikromanipülatör kullanın. Daha sonra boya üzerine mikropipet yerleştirmek için sahne ayarlayın. Enjeksiyon basıncını 200 ile 500 hektopascal, enjeksiyon süresini 0,1 ile 0,5 saniye arasında ve telafi basıncını beş dakika sıfıra ayarlayarak boyayı mikropipette toplayın.
Boya toplandıktan sonra boya kaydırağını çıkarın ve örneği mikroskop aşamasına yerleştirin. Daha sonra kompansasyon basıncını 30 ila 60 hektopascal aralığına yükseltin ve mikropipeti numuneye indirin. Embriyo bulmak ve embriyo ile mikropipet hizalamak için 10 kez objektif lens kullanın.
Objektif lensi 40 kez su daldırma lensine çevirin. Ve lensi PBS'ye batırın. Anti-HRP Cy3 ile işaretlenmiş nöronal morfolojiyi kontrol etmek ve enjeksiyon bölgesini belirlemek için floresan mikroskobu kullanın.
Embriyo odak olduğunda ilgi akson ucu ile nazik temas yapmak için mikropipet konumunu değiştirmek. Sonra boya damlacık görmek için enjeksiyon sırasında parlak alan mikroskobu kullanın. Ya DiD veya DiO ile ACC veya RP3 nöromüsküler kavşakta sağ karın hemisegmentinde boya bırakın.
Boyayı serbest bırakmak ve mikropipeti çıkarmak için el kontrolünü kullanın. Sonra bir sonraki enjeksiyon bölgesine geçin. Görüntülemeden önce bir orbital shaker üzerinde oda sıcaklığında bir saat için örnek kuluçka.
İnce çerkesler kullanarak, bantları cam kaydıraktan çıkarın. Numuneyi monte etmek için, dört köşeye az miktarda vakum yağı içeren bir kapak fişi hazırlayın. Dikkatle hava kabarcıkları önlemek için emin olun, örnek üzerine yerleştirilir.
Objektif lens ile slayt arasındaki çalışma mesafesini sağlamak için örnekteki boşluğu ayarlamak için kapak fişini aşağı itin. Görev mendilleri ile fazla PBS'yi çıkarın. Tamamen oje ile kapak kayma kenarları mühür.
Bir konfokal mikroskop ile 10 kez ve 100 kez büyütme görüntü ve görüntüJ yazılımı ile görüntüleri işlemek. Bu protokol, aCC motor nöron innerve kas bir ve RP3 motor nöron kasları altı ve yedi innerve etiket retrograd kullanılmıştır. ACC ve RP3 motor nöronlardan gelen dendritik dallar geniş bir çakışma gösterir.
Her iki nöron da iki farklı dendrit popülasyonu oluşturarak bipolardır. Bu yöntemin kantit yeteneklerini göstermek için, dendrite ipuçlarının toplam sayısı vahşi tip ve Dscam1 mutantlar olarak sayıldı. ACC ipsilateral dendrites yabani tip için gösterilmiştir, ancak birkaç ipsilateral dendritler Dscam1 mutant için gözlendi.
Bu prosedürü denerken, boya damlacık boyutunu yaklaşık 10-20 mikrometre olan çok önemli olduğunu hatırlamak önemlidir. Çift taraflı bant boyutunu test edin ve sonra enjeksiyon sitesine uygulayın. Bu prosedürü kullanarak, plazma zarının süper çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için DiD probunun fotoğraf değiştirilebilir özelliğinden yararlanabiliriz.
Bu şekilde nöromüsküler kavşakta sinaptik membranların ultra yapısal karakterizasyonu inceleyebilirsiniz. Tıklamayı yaptık. Mutant suşundaki aCC dendritlerinin henotypik analizini yaptık ve Dscam1-Dock-Pak enjeksiyonunun aCC'deki dendrit büyüme alanını tanımladığını keşfettik.
