KB NIH hibe GM54544 tarafından desteklenmektedir.

Bölüm 1: Ekipman ve Malzemeleri <ol><li> Drosophila embriyolardan Elektrofizyolojik kayıt ilk embriyonik diseksiyon teknikleri, başka vallahi video açıklanan yeterlilik gerektirir. </li><li> Drosophila embriyolardan Elektrofizyolojik kayıt standart yama kelepçe kayıt yapılandırmaları kullanır. Ayrıca diğer birçok hazırlıkları için uygun yama kelepçe kayıt donanım ve yazılım Drosophila embriyolar kayıt için uygundur. Drosophila embriyolar Diseksiyon sırasında bir kapak kayma yapıştırılmış olduğundan, kayıt haznesi kapağını fişleri kabul etmelidir. Lamel monte edildiği şekilde hazırlanması ve kalınlığı, mükemmel DIC optik ve uzun çalışma mesafesi objektif dik bir mikroskop gerektirir. </li><li> İki tür banyo çözümleri elektrofizyolojik kayıt için kullanılır; 1) &quot;standart&quot; (Jan Jan, 1976a) ya da &quot;modifiye standart&quot; (Broadie 2000) Salines, kayıt için diğer omurgasız sistemlerinde yaygın olarak kullanılan çözümler dayalı, ve 2) &quot;haemolymph gibi&quot; (HL) Salines (Stewart ve ark 1994), standart tuzlu ve Drosophila haemolymph ölçülen iyon konsantrasyonları arasında bir uzlaşmadır. Bu Salines hiçbiri doğru (Broadie 2000) kayıt için olumsuz haemolymph ölçülen iyon konsantrasyonları, taklit olduğu unutulmamalıdır. Standart tuzlu su içerir (mM): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 1.8 CaCl2, 72 sakaroz, 5 TES, pH 7,2. </li></ol> Bölüm 2: Kayıt Yapılandırması <ol><li> Fizyolojik deneyler için, küçük bir pleksiglas kayıt odasında disseke embriyo hazırlık yerleştirilir (&lt;0.5 ml) ve (diferansiyel girişim kontrast (Nomarski) optik ve uzun bir çalışma mesafesi 40-100X ile donatılmış dik bir bileşik mikroskop ile iletilen ışık görüntülenebilir genellikle 40X) su daldırma amacı (Broadie ve Bate, 1993a). Kayıtlar, yüksek sıcaklıklarda artan zorluk, genellikle oda sıcaklığında (16-22 ° C) altında yapılır (22 + ° C). Biz oda soğutma preapartion soğutma yerine, bunu başarmak. </li><li> Patch pipetler çeşitli fiber dolu bardak (örneğin borosilikat cam, 1 mm dış çapı) çekilebilir ve ipuçları 5-10 M son dirençleri yangın parlatılmış olmalıdır. Klorür gümüş topraklama kablosu banyosuna yerleştirilir. Sinyaller 2-10 Hz 8-kutuplu bir Bessel filtre ile filtrelenmiş ve ya on-line örneklenmiş dijital ya da daha sonraki analiz için saklanan bir yama klemp amplifikatör (örneğin Axopatch-1D, Axon Instruments) kullanılarak güçlendirilir. </li><li> Konvansiyonel patch-kelepçe kayıtları, en sık 18 ° C (~ 1 mikron id cilalı ipuçları ısı), borosilikat cam elyaf dolgulu çekti yama pipetler. Broadie et al, 1997;. Fergestad ve ark, 1999; Featherstone ve ark voltaj kelepçe (Standart holding potansiyelleri -60 -80 mV) (Broadie ve Bate, 1993a-d tespit multinucleate kas lifleri Şu kayıtları yapılır , 2000). Pipet yama çözüm içerir (mM): 120 KCl 20 KOH, 4 MgCl 2, 0.25 CaCl 2, 5 EGTA, pH 7,2 tamponlu 4 Na 2 ATP, Sakkaroz, 36 ve 5 TES. Kayıt elektrotları geri doldurulur. </li></ol> Bölüm 3: Kas Kaydı <ol><li> Prensip olarak, herhangi bir embriyonik kas bu hazırlık kaydedilebilir. Uygulamada, çoğu kayıt en iç kas tabakası (Broadie ve Bate, 1993a-c Bate, 1990), ventral uzunlamasına kaslar üzerinde yoğunlaşmıştır. Kayıtları da bu kas tabakası dorsal ve lateral kasları (; Auld ve ark 1995; Nishikawa ve Kidokoro, 1995; arkadaşları Baumgartner 1996 Kidokoro ve Nishikawa, 1994) yapılmıştır. Ancak, çoğu deneyleri dört uzunlamasına, karın kasları grup (6,7,12,13), (A2-A3) ön karın özellikle kas 6 odaklanmak. </li><li> Genç embriyolar (&lt;16 saat AEL) kas kayıt önce yok enzimatik tedavi gereklidir. Ancak, bir kas kılıfı daha sonra embriyo gelişir (&gt; 16 saat AEL) ve yama kayıt önce kollajenaz (kollajenaz tip IV, 1 mg / ml kalsiyum katyon ücretsiz salin, RT 0.5-2 dakika) ile temizlenmesi gerekir. Enzim tedavisi, kas üzerindeki mühür dirençleri genellikle&gt; 1 GΩ. </li><li> Patch-klemp kayıtları bir dizi standart teknikler kullanarak embriyonik kasları (; Broadie ve ark 1994, 1995, 1997; Broadie ve Bate 1993a-c Nishikawa ve Kidokoro, 1995). Bağlı hücre, herhangi bir standart yama kelepçe varyasyonlar, iç-dış-out - kas veya izole kas zarı yamaları tek kanal aktivitesini kaydetmek için istihdam edilebilir. Tek glutamat reseptör kanal aktivitesini (-60 mV ~ 12 pA) genellikle tüm hücre modunda kaydedilen spontan eksitatör birleşme akımlar (sEJCs) düşen faz üzerinde gözlemlenebilir. </li><li> Çoğu kayıt tam hücreli kayıt config yapılıraraya getirilir, hafif bir emme ya da bir elektrik &quot;buzz&quot; hücre bağlı devlet kolaylıkla başarılabilir. Kaslar voltaj kelepçe ya (-60 ile -80 mV tipik tutma potansiyelleri) veya akım kelepçe yapılandırmaları kaydedilebilir. Genç embriyoların (&lt;13 saat AEL) kasları etkili bir şekilde embriyonik myotubes (Broadie ve Bate, 1993a) arasındaki geniş kaplin nedeniyle gerilim-kelepçeli olarak değil.; Bu (14 + AEL saat) gelişim evreleri (Ueda sonra sırasında genellikle bir sorun değil. Kidokoro, 1996). </li><li> Nystatin delikli yama klemp kayıt tam hücreli standart teknikleri (Broadie ve Bate, 1993a) ile elde edilen kayıtlar doğrulamak için kullanılabilir. Perforasyonu çözüm aşağıdaki gibi yapılır: 10 mg pluronic F-127 (Molecular Probes p-1572), 20 ml DMSO çözülür ve 10 mg Nystatin stok yapmak için bu çözüm çözülmüş. Stokunun 100 ul kayıt çözümü için 5 ml filtreli pipet çözüm eklenir. Tüm hücre akıntıları, genellikle mühür oluşumu &lt;3 dakika sonra elde edilir. Seri direnç çoğu durumda belirgin şekilde artar ve hücreler (Broadie ve Bate, 1993a) artan bir kaçak akım gelişebilir. </li><li> Içe kalsiyum akımı (I Ca): olgun embriyonik hücre tam voltaj kapılı akımı (larva) kas beş önde gelen bileşenleri (; Zagotta ve ark 1988 Broadie ve Bate, 1993b Wu ve Haugland, 1985) oluşur iki hızlı, inaktive akımları, gerilim-kapılı (A) ve kalsiyum-bağımlı (I CF) olmak üzere dört dışa potasyum akımları (Tsunoda ve Salkoff, 1995), ve iki gecikmiş, non-inaktive akımları, gerilim-kapılı (I K) ve kalsiyum-bağımlı (CS). İyon-ikame deneyler voltaj-klemp sırasında tüm hücre yanıtı (Broadie ve Bate, 1993b) bu ​​akımları incelemek için kullanılabilir. </li></ol> Bölüm 4: Nöromüsküler Kavşak Uyarılma ve Kayıt <ol><li> NMJ stimülasyon en yaygın ve güvenilir bir yöntem segmental periferik sinir bir cam üzerindeki emme elektrot kullanır. Emme elektrotlar fiber dolu elektrot cam (1-1.5 mikron dış çapı) çeşitli çıkarılmış olabilir ve istenen yapılandırma (~ 5 mikron iç çapı) elde etmek için yangın parlatılmış olmalıdır. Sıkı bir mühür formu için uygun segmental motor sinir küçük bir segment (&lt;50 mikron) hafif bir emme ile pipet içine çekilir. </li><li> CNS çıkış noktasının yakınında sinir bir döngü içinde çizerek sağlam sinir teşvik etmek yaygındır. Bu yaklaşım, sağlam hazırlanması kolay stimülasyon sağlar, ancak spontan MSS-uyarılmış aktivite uygulanan stimülasyon paradigma üzerine bindirilmiş oluşabilir dezavantajı vardır. Bir alternatif kesim motor sinir teşvik etmektir. MSS kaldırılırsa, bu yordamı sinir streç eğilimi ve zarar görmesine neden olabilir etse de, bu elde edilebilir. Sinir, aynı zamanda keskin bir cam mikroelektrot ile kesilmiş, ancak bu prosedür sıkıcı ve zor olabilir. Bu kayıtlar bozulmamış hazırlık yapılmış olması tavsiye edilir. </li><li> Uyarım çeşitli paradigmalar ile uygulanabilir. Kısa stimülasyonu (0,2-1 msn) en iyi şekilde çalışır ve stimülasyon yoğunluğu emme yapılandırma (genellikle 1-5 V) bağlıdır ve her hücre için deneysel olarak tespit edilmelidir. Motor sinir stimülasyonu Suprathreshold en iyi biraz üstünde uyaran gücünü (1-2 volt) eşik ayarlayarak elde edilir. Yukarıda açıklandığı gibi Uyarılmış NMJ yanıtları yama kenetli kas kaydedilir. Şok artifakı ölçüde izole bir sanal zemin kullanımı ile azaltılabilir. </li><li> Standart emme elektrot sinir stimülasyonu daha az güvenilir bir alternatif, merkezi sinir sisteminin (Nishikawa ve Kidokoro, 1995) doğrudan uyarılması. 3-4 M KCl (veya KAC) ile dolu bir mikroelektrot ventral ganglion ve yoğunluğu microamp ~ 2 ~ süresi 2 milisaniye teslim edilir (Dietcher ve ark 1998) pozitif bakliyat ortasına yerleştirilir. Elektrot ucu stimülasyonu istenilen hemisegment yakın neuropil olmalıdır. Sinaptik iletim standart yapılandırma yama kenetli kas kaydedilir. </li><li> Embriyonik NMJ, farklılaşma boyunca tüm hücre patch-kelepçe kayıt erişilebilir. Eksitatör junctional akımı (EJC) kayıtları için, sinyalleri, (genellikle 1-2 KHz) filtreli, standart bir yama klemp amplifikatör ile kayıt altına alınır, bir analog-dijital arabirimi kullanan bir dijital sinyal dönüştürülür ve kullanarak bir bilgisayarla birlikte satın aldı uygun yazılım. </li></ol> Bölüm 5: Nöromüsküler Kavşak Kimyasal ve İlaç Uygulamaları <ol><li> Herhangi bir küçük, ücret molekül etkili embriyonik NMJ (Fergestad ve ark 1999, 2001 Aravamudan ve ark, 1999) üzerine iontophoresed olabilir. Iyontoforez pipetler, değişken süreler için uygulamaları ile olumlu ya da olumsuz akım darbeleri kullanarak belirli yapılandırmalar için çekilmiş olabilir. Pu arasındaki sızıntıyı önlemek için hayati önem taşımaktadıruygun bir karşıt desteğiyle lses mevcut (1993d Broadie ve ark. Featherstone ve ark 2002, 2005;. Rohrbough ve ark 2007). Bu desteğiyle mevcut büyüklüğünü pipet yapılandırma ile değişir ve deneysel olarak tespit edilmelidir. </li><li> (Broadie ve Bate, 1993c); pek çok deney, 100 mM stok solüsyonu (pH 8-9 Monosodyum tuz) kullanarak NMJ nörotransmitter, L-glutamat (Jan Jan, 1976b) ile yapılır olmuştur. Yüksek direnç iyontoforez pipetler (M 100-200), glutamat reseptör (gluR) haritalama (Broadie ve Bate, 1993d) için kullanılabilir ve düşük direnç pipetler (M 20-50) toplam gluR yanıt (Broadie ve ark tahmin etmek için kullanılmıştır. 1995, 1997; Featherstone ve ark 2002, 2005; Rohrbough ve ark 2007). Kısa akım sızıntısını önlemek için küçük, pozitif destek ile olumsuz akım (~ 10 nA) çalışması, bakliyat (0.1-1 ms). </li><li> Sigara-ücret ve ücret molekülleri basınç ejeksiyon (Fergestad ve Broadie, 2001; Featherstone ve ark 2001) tarafından uygulanabilir. Başvuru için, çözüm içeren bir basınç ejeksiyon pipet (&lt;5 mm iç çap) sinir terminali (&lt;10 mikron) yakın konumlandırılmış. Çıkarılabilen çözüm picospritzer (5-10 psi) veya diğer basınçlı hava kaynağı (Featherstone ve ark, 2002) kullanılarak yapılabilir. Normal banyo salin ile uzun süreli deneyler sırasında, kayıt odası (hacmi &lt;0.5 ml) (0.2 ml / sn 0.1) sürekli perfüze edilmelidir. </li><li> Pek çok deney, füzyon sinaptik veziküller (Aravamudan, ve ark, 1999; Fergestad ve ark, 1999;. Featherstone, ve ark, 2000, 2002 Broadie ve ark 1995) tetiklemek için Hiperozmatik tuzlu su ile yapılmıştır. Gibi glutamat reseptörleri ve kara dul örümceğinin zehir içeren latroinsectotoxin (Broadie ve ark 1995) karşı argiotoxin 636 gibi toksinler, Diğer deneyler yapılmıştır. </li></ol> Bölüm 6: Tamamlayıcı Nöromusküler Junction Vital Görüntüleme Teknikleri <ol><li> Sinaptik vezikül kinetiği floresan lipofilik stryl boyalar (; Rohrbough ve ark 2004 Fergestad ve Broadie, 2001) ile izlenebilir. Veziküllerin doğrudan dağıtım gözlenen ve endositoz ve ekzositoz oranları ölçülen olabilir. Birçok varyasyonları farklı floresan özellikleri (FM4-64, rodamin-FM1-43, floresein gibi) ile yapılmıştır. Orijinal boya Değişiklikler değişmiş hidrofobik özellikleri olan ürünler elde edildi ve bu nedenle farklı yıkanmaya kinetiği; çok daha hızlı membran örneğin, FM2-10 ayrışmaktadır. </li><li> Stryl boya ile embriyonik NMJ etiketlemek için, 10 mcM FM1-43 artmış ekstraselüler potasyum (50-90 mM) (Fergestad ve Broadie, 2001) kullanarak 1-5 dakika yüklenebilir. Daha fizyolojik bir yaklaşım, bir sinir emme elektrot tarafından uyarılması ile elde edilebilir. Hazırlıklar, Ca 2 + ücretsiz tampon 5 dakika sonra tekrar tekrar yıkanıp, floresan (boyalı sinaptik veziküller temsil) ölçülen korudu . Ekzositoz ölçmek için, bir yüksek potasyum veya sinir elektrik stimülasyonu kullanarak boya boşaltın. </li><li> GFP türevleri ile füzyon proteinleri, çok renkli etiketleme (. Zhang ve ark 2002 Marka, 1999) embriyonik NMJ sinaps izin üretilmiştir. GFP etiketli proteinlerin ifade birçok transgenik genel membran belirteçleri (örneğin mCD8-GFP), postsinaptik belirteçleri (örneğin Shaker GFP, GluRIIA-GFP), sitoskeletal (örneğin aktin-GFP, moesin-GFP, tubulin GFP) ve mitokondriyal dahil olmak üzere mevcut belirteçleri (örneğin Sitokrom C-GFP) ve sinaptik vezikül işaretleri (örneğin synaptobrevin-GFP, synaptotagmin-GFP; Zhang ve ark, 2002). </li><li> GFP gazetecilere, son derece dinamik ve gelişimsel özellikleri ya da mutant fenotipleri (Featherstone ve Broadie, 2000) değerlendirmek için kullanılabilir bölmeleri etiketi. Ağartma ve ardından floresan (sıkı bağlamak) kurtarma gözlemleyerek en az larva Drosophila NMJ (Yan ve Broadie, 2007; Zhang ve ark, 2002), mümkün olduğu gösterilmiştir. Ancak dikkatli bir kelime, bu belirteçlerin bazıları tamamen boş mutantlar kurtarmak değil ve hatta normal NMJ fizyolojisini değiştirebilir. </li></ol> Bölüm 7: Orta Motor Nöronlar Kaydı <ol><li> Birçok embriyonik nöronların soma konumu ve projeksiyon morfolojisi (Goodman ve Yılmaz, 1993; Landgraf ve ark 1997 Bate ve Martinez-Arias, 1993) göre ayrı ayrı tespit edilebilir. Ayrıca, GAL4/UAS sistemi (Marka ve Perrimon, 1993) tanımlanabilir nöron popülasyonları (Baines ve ark, 1998) görselleştirmek için GFP ifade hedefleyebilir. Dört motor nöronların (ACC ve RP1-4) ve bir interneuron PCC (Baines ve ark, 1998, 1999, 2001; güncel Kayıt çalışmalar embriyonik ventral sinir kablosu (VNC) içinde beş yüzeysel, dorsal nöronlar bir grup üzerinde yoğunlaştı. Rohrbough ve Broadie, 2002; Featherstone ve ark 1995). </li><li> Tespit nöronların hücre gövdeleri tam hücreli yama kelepçe kayıt elektrotları erişilebilir. VNC neurolemma kılıf ilk proteaz (Baines ve Bate, 1998 ile kısa odak tedavi ile temizlenmesi gerekir; Baines et al, 1999; Rohrbough ve Broadie, 2002). Dorsal nöronal hücre gövdeleri% 0.5-1 proteaz (kayıt salin yazın XIV (Sigma)) içeren geniş çaplı bir yama (~ 20 mikron) pipet kullanarak maruz kalmaktadır. MSS kılıf malzemesi kılıf rüptürlerinin (Featherstone ve ark 1995) kadar 1-2 dakika pipet içine emme çizilir. Sırasında hücresel kimlik kayıtları, lucifer sarı (Dipotasyum tuz, 1-2 mg / ml) onaylamak için hücrenin konumu ve morfolojisi görselleştirmek için yama çözüm eklenebilir. </li><li> Standart tam hücreli voltaj ve akım-klemp kayıtları (Featherstone ve ark, 2005 Rohrbough ve Broadie, 2002) yapılabilir. Dış kayıt tuzlu su içerir (mM): 140 NaCl, 3 KCl, 2 MgCl 2 CaCl 2, 4, 5 Hepes, 10 sakaroz, 2 NaOH (pH 7,2). Yama çözümü içermektedir (mM): 140 K-Asetat, 2 MgCl 2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 2 Na2-ATP, ~ 6 KOH (pH 7,2). Gerilim-klemp kayıtları 18 ° C -60 mV tutma potansiyelleri yapılır Tipik düzeltilmemiş dinlenme potansiyelleri -45 ile -65 mV aralığında (-52,9 ± 7.5 mV, ortalama ± SD, n = 78). </li><li> Kullanılabilir Testler gerilim-kapılı iyon akımları (Baines ve Bate, 1998), tekrarlayan aksiyon potansiyelleri, synaptically aracılı aktivite ve agonist-kapılı yanıtları (Baines ve ark, 2001) ortaya koymaktadır. Motor nöronların sinaptik giriş dakikada birkaç kez veya daha fazla (Baines ve ark meydana gelen AP-aracılı hem hızlı hızlı eksitatör sinaptik akımları (EKH) ve eksitatör giriş, periyodik ve sürekli (1 sn kadar süre) bölüm şeklinde kaydedilir. , 1999; Baines ve ark, 2001). </li><li> Hücre soma iontophoretically uygulanan asetilkolin (Ach) ve inhibitör verici GABA (Featherstone ve ark 2005 Baines ve Bate, 1998) cevap. ACh dH 2 0 100 mM ACh içeren bir keskin mikroelektrot ile pozitif akım tarafından agonist iyontoforez lehine 4-5 pH nöronal soma iontophoretically uygulanan olabilir. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Harrison ve arkadaşları 1994; Sweeney 1995 ve ark. Renden ve ark 2001; Huang ve ark 2006; ventral uzunlamasına kas 6 A2-A3 kayıt için en sık kullanılan hedef (Broadie ve Bate, 1993a-d segmentleri. Mohrmann ve ark 2008). Olgun embriyo ve yeni yumurtadan ilk instar larva (20-21 saat AEL 25 ° C = kuluçka), kas 6 tüm hücre kapasitans genellikle 25-30 pF ve M giriş dirençleri 20-40, gelişimsel yaşla birlikte değişiyor. Picoamps onlarca (13-14 saat AEL) 1-2NA (20-21 saat AEL) Maksimal NMJ sinaptik akımları aralığı, yaş bir fonksiyonu olarak hızla artmaktadır. Doğrudan ölçüt glutamat kapılı akımları kuluçka için sadece önceden picoamps yüzlerce (13-14 saat AEL) 1.5 4NA maksimal cevaplar verir. Seri direnç hataları (toplam akım X serisi direnç) genellikle &lt;5 mV, ancak, olgun, ön kuluçka embriyolar, 10 gibi yüksek olabilir + mV ve böylece seri direnç tazminat tavsiye edilir. Embriyonik kaslar, ortalama 10-30 mm çap ve 40-80 mikron ortalama uzunluğu neredeyse ideal bir alan kelepçe parametrelerini göstermek için görünür. Hücre kelepçe zaman sabitleri (R serisi XC hücre) ortalaması 0.25 &#39;den daha az msn. Olgun embriyo ve yeni yumurtadan larva, dorsal motor nöron nüfus, daha sınırlı bir kayıt konu olmuştur. Nöronal soma kayıtları, 1,8-2,5 pF (2.0 pF ortalama), M 40-60 seri direnç ve ~ 5 GΩ (; Featherstone ve ark 2005 Baines ve Bate, 1998) giriş direnci aralığında tüm hücre kapasitans ortaya koymaktadır. Bu hücreler embriyonik olgunlaşması sırasında açıkça boyut ve karmaşıklık olarak büyümeye ve bu büyümenin larva gelişimi boyunca devam eder. Üçüncü instars, tüm hücre kapasitans, 17-20 pF, seri direnç M 25-37 ve giriş direnci ortalama ~ 900 M (Rohrbough ve Broadie, 2002; Richard Baines, kişisel iletişim). İyonik conductances gelişimi boyunca artış, ancak akım yoğunluğu (pA / pF) dikkate değer sabit kalır. Olgun embriyolar, hızlı ESC olaylar ve ortalama ~ 500 milisaniye (Baines ve Bate, 1998; Featherstone ve ark 2005) uzun süreli akımlar ile genlik 75-100pA ortalama sinaptik akımları,. Embriyolar, bu sürekli olaylar dakikada ortalama 3-5, ilk instar (Richard Baines, kişisel iletişim) ~ 20 dakikada artan. Drosophila nöronlar morfolojik karmaşıklığı ve membran özellikleri, neredeyse imkansız soma ötesinde hücrenin düzgün gerilim kelepçe hale getirdiğini unutmayın . Bu yüzden dikkatli kayıtları yorumlanması gerekir.

The authors have nothing to disclose.

Drosophila embriyolardan Elektrofizyolojik kayıt manuel manipülasyon ve diseksiyon gerektirir. Hazırlanması, sağlık, ve bunun sonucunda kalite kayıtları, kayıt için kırılgan embriyonik dokularda hızla ve özenle hazırlamak mümkün bağlıdır ve sonra deney çalıştırmak. Deneyci bir kerede çözmek için çalışıyoruz önce embriyonik diseksiyonlar ve yama kelepçe elektrofizyoloji yeterli olmalıdır. Kayıtlar &quot;şekli değiştirilmiş standart&quot; ya da ...

electrophysiological recording in the drosophila embryo

Drosophila, embriyonik gelişim ve fonksiyonel nörobilim çalışma için önde gelen genetik bir model . Geleneksel olarak, bu alanlar, büyük ölçüde bağımsız geçmişleri ve bilimsel topluluklar ile, birbirinden tamamen izole edilir. Ancak, bunlar genellikle birbirinden farklı alanlar arasında arayüz fonksiyonel elektriksel sinyal özellikleri ve nöral devre oluşumu son aşamalarında fonksiyonel kimyasal sinaps farklılaşma edinimi temel gelişim programları. Bu arayüz, soruşturma için son derece önemli bir alandır. Drosophila, fonksiyonel gelişimi bu aşamalarda son embriyogenez üçüncü sırasında &lt;8 saatlik bir süre (25 ° C) sırasında oluşur. Bu geç gelişim döneminde uzun, sert, geçirimsiz epidermal manikür birikimine soruşturma nedeniyle dirençli kabul edildi. Bir atılım önceden yerel kontrollü geç evre embriyo diseksiyonu etkinleştirmek için manikür uygulanabilir, su polimerize cerrahi yapıştırıcı uygulama oldu. Dorsal longitudinal insizyon ile deneysel olarak incelenmesi için embriyonun ventral sinir kablosu ve vücut duvarı kas açığa, düz belirtilen olabilir. Tüm hücre patch-klemp teknikleri, daha sonra ayrı ayrı tanımlanabilir nöronlar ve somatik kaslar kayıt istihdam edilebilirler. Bu kayıt yapılandırmaları görünümünü ve olgunlaşma iyonik akımlar ve nöronlar ve kaslar hem de aksiyon potansiyeli yayılma izlemek için kullanılır olmuştur. Bu elektriksel özellikleri etkileyen genetik mutantlar, iyon kanalları ve ilgili sinyalizasyon kompleksleri moleküler yapısı ortaya çıkarmak için ve fonksiyonel farklılaşmanın moleküler mekanizmaların araştırılması başlamak için karakterize edilmiştir. Belirli bir odak noktası, merkezi sinir sistemi ve çevre, hem sinaptik bağlantıları montaj edilmiştir. Glutamaterjik nöromüsküler bileşke (NMJ), optik görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıt bir kombinasyonu en erişilebilir. Bir bardak emme elektrot gerilim kenetli kas eksitatör bileşke akım (EJC) kayıtları ile, periferik sinir uyarmak için kullanılır. Bu kayıt yapılandırma sinaps fonksiyonel farklılaşma grafik ve presinaptik glutamat salınımını özelliklerin görünümü ve olgunlaşma izlemek için kullanılır olmuştur. Buna ek olarak, postsinaptik özellikleri, görünüm ve olgunlaşma glutamat reseptör alanları ölçmek için doğrudan kas yüzeye glutamat iyontoforez veya basınç uygulaması ile bağımsız test edilebilir. Böylece, hem de pre-ve postsinaptik unsurlar embriyonik sinaptogenez sırasında ayrı ayrı veya birlikte takip edilebilir. Bu sistem, ağır embriyonik sinaps oluşumunu bozar ve dolayısıyla sinaps bağlantıları ve fonksiyonel sinaptik sinyalizasyon özellikleri şartname ve farklılaşmasını düzenleyen moleküler mekanizmaları ortaya genetik mutantları ve karakterize etmek için kullanılmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo at JoVE.com

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Elektrofizyolojik kayıtlarından<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar gelişmekte olan kas ve nöron elektriksel özellikleri yanı sıra fonksiyonel sinaptogenez glutamaterjik nöromüsküler kavşak ve merkezi kolinerjik ve GABAerjik sinaps karakterizasyon analizleri izin verir.

Elektrofizyolojik Kayıt Drosophila Embriyo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

electrophysiological-recording-in-the-drosophila-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

11.4K Görüntüleme.  University of Illinois. Elektrofizyolojik kayıtlarından Drosophila Embriyolar gelişmekte olan kas ve nöron elektriksel özellikleri yanı sıra fonksiyonel sinaptogenez glutamaterjik nöromüsküler kavşak ve merkezi kolinerjik ve GABAerjik sinaps karakterizasyon analizleri izin verir.

Video: Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Civciv Embriyo Sinir İndüksiyon için Testi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

Drosophila Larva NMJ Synaptic Potansiyeller kayıt için Elektrofizyolojik Yöntemler

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Hasat ve hazırlanması Drosophila</emElektrofizyolojik Kayıt ve Diğer İşlemler> Embriyolar

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Dayak Kalp görselleştirme Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Ambulatory ECG Recording in Mice

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although the surface ECG is utilized for short-term measurements of waveform intervals, it is not practical for long-term studies of heart rate variability or the capture of rare episodes of arrhythmias. Implantable ECG telemeters offer the advantages of simple surgical implantation, long-term recording of electrograms in ambulatory mice, and scalability with simultaneous recordings of multiple animals. Here, we present a step-by-step guide to the implantation of telemeters for ambulatory ECG recording in mice. Careful adherence to aseptic technique is required for favorable survival results with the possibility of implantation and recording from weeks to months. Thus, implantable ECG telemetry is a valuable tool for detection of critical information on cardiac electrophysiology in ambulatory animal models such as the mouse. 

Telemetric ECG has emerged as an essential tool in evaluating animal models for cardiac arrhythmias and sudden cardiac death. Here, we present a stepwise guide to telemetric ECG recordings for application in long-term ambulatory ECG monitoring in mice.

Farelerde ambulatuvar EKG Kaydı

Telemetric ECG recording in mice is essential to understanding the mechanisms behind arrhythmias, conduction disorders, and sudden cardiac death. Although ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

Erken Civciv Embriyo morfogenetik Doku deformasyonlar Takibi

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...