Bu yöntem kolayca diğer floresan proteinlerden sinyalleri gözlemlemek için adapte edilebilir veya diğer yetişkin aksonların görüntü için kullanılabilir Bu tekniğin ana avantajı mükemmel bir üç boyutlu yeniden yapılanma ve aksonların ve terminal arbors görselleştirme kolaylaştırmak. % 70 etanol ile bir cam çok kuyu plaka kuyuların uygun sayıda doldurarak başlayın. Her bir kuyuya herhangi bir yaş veya cinsiyetten 15 ila 20 karbondioksit anestezili sinek eklemek için bir fırça kullanın ve tamamen su altında kalana kadar sinekleri yavaşça etanolün içine daldırın.
Bir dakikadan fazla kalmadıktan sonra, fosfat tamponlu tuzlu tuzlu da %0,3 non-iyonik yüzey aktif deterjan çözeltisi ile sinekleri yıkama başına en az 10 dakika durulayın. Son yıkamadan sonra, torasik segmente veya bacaklara zarar vermeden her sineğin başını ve karnını çıkarmak için terlikler kullanın ve bir bacağı göğüs segmentinden ayırmak için coxa-toraks kavşağına hafifçe basınç uygulamak için ince keçelerin ucunu kullanın. Dört santigrat derece bir gecede kuluçka için buz üzerinde taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit içeren yeni bir çok kuyu plaka bir kuyubacaklar yerleştirin.
Bacakları, iyi sabitlenmiş bacaklar elde etmek için yüzdürmelerine izin vermeden, fiksasyon tamponuna hafifçe itmek önemlidir. Ertesi gün, bacakları her yıkamada 20 dakika boyunca taze %0,3 non-iyonik yüzey aktif deterjan çözeltisinde beş kez yıkayın. Son yıkamadan sonra deterjanı montaj ortamıyla değiştirin ve bacakları en az 24 saat montaj ortamında tutun.
Ertesi gün, cam mikroskop slayt kaplamalı sonuna% 70 gliserol yaklaşık 20 mikrolitre ekleyin ve 22 tarafından 22 milimetre lik coverslip ile gliserol kapağı. Daha sonra, coverslip'in sağına yaklaşık 10 mikrolitrelik montaj ortamı ekleyin ve 10 mikrolitrelik hattın sağına ikinci bir 30 mikrolitrelik montaj hattı uygulayın. İnce çerkesler kullanarak, bir bacağı çok kuyulu plakadan bir damla orta dan dış bir tarafta yukarı veya aşağı doğru montaj ortamının 10 mikrolitrelik şeridine aktarın.
Altı ila sekiz bacak monte edilip hizalanana kadar tekrarlayın ve ikinci kapak kaymasının ilk kapak kaymasına hafifçe dayanacak şekilde bacaklar üzerinde ikinci bir kapak kayması yerleştirin. Sonra yerine onları güvenli için kapakları her köşesinde oje kullanın. Bacakları görüntülemek için, 488 nanometre lazer ve iki dedektörü aynı anda gfp ve cuticle otomatik floresan elde etmek için ilk parça kurmak için kullanın.
20 ila 25X yağ daldırma hedefini seçin ve çözünürlüğü 12 bit derinlikte 1024 piksele ayarlayın ve z aralığını bir mikrometreye ayarlayın. Kaydırağı mikroskop aşamasına yükleyin ve her iki dedektör için de aynı lazer gücünü kullanarak, parlak bir GFP sinyali elde etmek için ilk dedektörün kazancını ayarlayın ve yüksek mite sinyali olan bazı alanların bu dedektörde doymuş bir sinyal üretmesini sağlamak için ikinci dedektörü ayarlayın. Daha sonra, bir bacak uzatılmış veya tek bir çerçevede görüntülenemeyecek kadar büyükse, tüm bacağı yakalamak için döşemeyi veya konum seçeneklerini kullanarak bacakları görüntüleyin.
Görüntü işleme için ImageJ Fiji'deki confocal yığınını açın ve TIFF formatında olmayan görüntüleri açmak için Bio-Formats eklentisini kullanın. Kanalları bölmek için Görüntü, Renk ve Kanalları Böl'ü seçin. GFP sinyalinden miğfiz sinyali çıkarmak için İşlem ve Görüntü Hesap layıcısı'nı açın ve dedektörden bir deki desteyi görüntü olarak seçin.
Çalışma penceresinde, yalnızca endojen GFP sinyalinin elde edilebilmeleri için dedektör iki'den parçayı görüntü iki olarak seçin. Endojen GFP sinyali için maksimum yoğunluklu projeksiyon oluşturmak için Görüntü, Yığınlar, Z Protect'i kullanın. Parlaklığı ve kontrastı ayarlamak için parlaklık denetim penceresindeki denetimleri kullanın.
Ardından, GFP yığınını dedektör ikiden elde edilen yalnızca mite likörü yığınıyla birleştirmek için Görüntü, Renk ve Birleştirme Kanalları'nın ardından, manikül için ortalama bir yoğunluk oluşturun. Bu, dokuya özgü GFP sinyalinin yanı sıra bacak segmentlerindeki akson arbors'u belirlemeye yardımcı olacak miğkül sinyalinden oluşan bir RGB görüntüsüyle sonuçlanır. Makroyu kullanmak için confocal yığınını açın ve Resim, Ayarla ve Parlaklık/Kontrast'ı tıklatın.
Ardından makroyu çalıştırmak ve yönergeleri izlemek için Eklenti ve Makro Çalıştır'ı tıklatın. Görüntü hesap makinesi penceresinde işlemi belirtmeniz istendiğinde, resim birini yığın olarak seçin. İşlem penceresinde, çıkarma'yı seçin.
İkinci görüntüyü yığın olarak seçin. Karşıtlığı ayarlamanız istendiğinde, GFP'nin maksimal projeksiyon görüntüsünün parlaklık kontrastını ve kırışlı nın ortalama projeksiyonunun parlaklık kontrastını ayarlamak için parlaklık kontrol penceresindeki denetimleri kullanarak GFP'yi yeşil ve manilü gri renkte gösteren her iki sinyalin rgb birleştirilmiş görüntüsünü oluşturun. Sonra yığın bir sonuçlarını birleştirin ve bir sonraki aşamada kullanılabilecek birleştirilmiş GFP ve miğkül yığını oluşturmak için iki yığını.
Bacakları üç boyutlu olarak görselleştirmek için, uygun bir 3B yazılım programında RGB yığınını açın. Açılır pencerede, mod dönüştürme bölümündeki tüm kanalları seçin ve önceki çözümlemeden elde edilen voxel boyutunu girin. Kanal bir modülünde, Sağ tıklayın ve Ekran ve Volren seçin.
Sonra Volren modülüne sol tıklayın. Özellikler bölümünde Gelişmiş'e sol tıklayın ve DDR'yi seçin. Sonra miğfer arka planını görmek için gama değerini ayarlayın.
Kanal iki modülünde, Sağ tıklayın ve Volren Görüntüle'yi seçin. Sonra Volren modülü, Edit ve volrenGreen.col seçin tıklayın sol. Bu yordamı kullanarak, mitekten gelen sinyal, bacaklardaki aksonlarin konumlandırılmasını belirlemek için GFP sinyali ile birleştirilebilir.
İyi sabit lenmiş bacaklar elde etmek kritik derecede önemlidir. Düzgün sabit bacaklarda, bacaklar içinde iç yapılar tek tip bir renk ve trakealar, koyu, görünür. Kötü sabit bacaklarda tarsus ve tibia'da koyu madde bulunur ve trakeal sistem femur ve coxada açıkça görülemez.
Burada açıklanan prosedür, motor nöron aksonlarda floresan ekspresyonu yüksek çözünürlükte kalın ve oto floresan bir mikülilen algılama zorluğunun üstesinden gelir. Yani elde edilen temiz ve detaylı floresan sinyali, 3Boyutlu görüntüleme programları kullanarak akson arbors'un üç boyutlu özelliğini görselleştirmemizi ve quantimize etmemizi sağlar. Yani bu teknik bize sadece motor nöron gelişimini incelemek için bir model olarak yetişkin Drosophila kullanmak için izin verecektir, ama aynı zamanda çalışma, lokomotor sistem entegre ERAS gibi dejeneratif hastalığın etkisini anlamak için.
