RNA immünopresidasyon tandem ve ardından sıralama veya RIPiT-Seq, RNA'nın hangi bölgelerinin belirli bir rna bağlayıcı protein çifti ile bağlı olduğunu belirlemek için kullanılan bir yöntemdir. RIPiT'in en eşsiz avantajı iki arınmada iki farklı proteini hedeflenebilme yeteneğidir. Bu diğer komplekslerden bir kompozisyon farklı RNA protein kompleksi için zenginleştirmek için güçlü bir yol sağlar.
Ayrıca, RIPiT-Seq UV-crosslinking bağımsız, ve doğrudan bağlamadan RNA hareket birçok protein uygulanabilir. Bu yöntem doğrudan tedavi veya tanı doğru genişletmek olmasa da, RNA bağlayıcı proteinler ve RNA işleme nöropatiler ve kanser gibi çeşitli hastalıklar ile ilişkili olmuştur. RIPiT-Seq, hastalığa bağlı RNA bağlayıcı proteinlerin fonksiyonlarını incelemek için bir araç sağlar.
RIPiT-Seq bir epitop etiketli protein ifade edilebilir bir sistem gerektirir. Sadece HEK293 hücrelerinde test edilmiştir ve hücre kültürüne en uygun olandır. Ancak, crispr kullanarak proteinleri etiketleme yeteneğimiz ile, RIPiT-Seq çeşitli modern sistemler için uygulanabilir.
RIPiT'nin başarısı iki etkin immünoprepitre bağlıdır, bu nedenle kullanılan antikor için immünopresidasyon koşullarını optimize etmek kritik olacaktır. Ayrıca, RNA ile çalışmak uygun önlemler gerektirir, bu nedenle RNA ekstraksiyonu sırasında ve sonrasında RNa içermeyen reaktifler kullanılmalıdır. Prosedürü gösteren Lauren Woodward, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olacak.
15 santimetre lik plakabaşına 15 mililitre soğutulmuş PBS ile monolayer hücreleri hafifçe yıkayarak başlayın. Sonra pbs 30 mililitre içine hücreleri kazımak ve 50 mililitrekonik tüp onları toplamak. 4 santigrat derecede 10 dakika 400 g santrifüj ederek hücreleri pelet ve supernatant atın.
Dört mililitre buz gibi hipotonik lisis tamponu ekleyin ve hücreleri yeniden askıya almak için P1000 pipeti kullanın. Lysate'yi beş mililitrelik bir tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın. Bir buz banyosu ve el yazması yönlere göre sonicate lysate yerleştirin.
Daha sonra tuz konsantrasyonu 150 milimolar ayarlamak için beş azı lı sodyum klorür 108 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, 12, 000 g 4 santigrat derece 10 dakika lysate santrifüj ve batı leke analizi için supernatant 20 mikrolitre toplamak. Pre-wash FLAG agarose boncuklar el yazması yönlere göre ve beş mililitrelik bir tüp içinde boncuk 750 mikrolitre kalan supernatant uygulayın.
FLAG agarose boncukları hücre ekstresi ile dört derece santigrat derecede nazik karıştırma ile 1-3 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 400 g'da 400 gr'da boncukları 4 derece santigrat derecede bir dakika peletleyin ve batı leke analizi için 20 mikrolitre süpernatant toplayın. Kalan supernatant atın ve iso yıkama tampon dört mililitre onları resuspend tarafından boncuk yıkayın.
Pelet boncuklar tekrar ve supernatant kaldırın. Resûl-i Kusmisi 750 mikrolitre iso yıkama tamponunun el yazması yönergelere göre seyreltin ve FLAG agarose boncuklar ekleyin. Karışımı dört santigrat derecede hafif bir karıştırma ile kuluçkaya yatırın ve sonra boncukları santrifüjle peletlayın.
Batı leke analizi için 20 mikrolitre supernatant toplayın ve geri kalanını atın. Daha sonra boncukları daha önce açıklandığı gibi iso yıkama tamponuyla yıkayın. Daha sonra, boncuklara 375 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyerek ve karışımı bir ila iki saat boyunca dört santigrat derecede hafifçe sallayarak yakınlık elüsyonu gerçekleştirin.
Kuluçkadan sonra, boncukpelet ve batı leke analizi için elüsasyon bir 15 mikrolitre aliquot toplamak. Afinite elution devam ederken, manyetik boncuk antikor çekimi gerçekleştirin. Bir mililitre iso yıkama tamponunda 50 mikrolitre manyetik boncuk yıkayarak başlayın.
Konjugasyon tampon 100 mikrolitre boncuk resuspend ve antikor uygun miktarda ekleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında en az 10 dakika boyunca boncuk kuluçka. Manyetik boncukları çekim tamponuyla iki kez yıkayın ve 375 mikrolitre RIPiT seyreltme tamponunda boncukları yeniden askıya alın.
İmmünyağış kadar buz üzerinde boncuk saklayın. Flag alüse elution antikor-çiftli manyetik boncuklar ve dört santigrat derece bir ila iki saat boyunca nazik karıştırma ile kuluçka uygulayın. Manyetik boncukları bir mıknatısla yakalayın ve batı leke analizi için 15 mikrolitre süpernatant toplayın.
Daha sonra boncukları iso yıkama tamponu ile yedi kez yıkayın. 100 mikrolitre net numune tamponundaki manyetik boncukları yeniden sulayarak ve süspansiyonu 10 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırarak elution'ı denatüre etmeye devam edin. Kuluçka sırasında, düzenli olarak onları yeniden askıya almak için boncuk flick.
Manyetik boncukları bir mıknatısüzerinde yakalayın ve batı leke analizi için 15 mikrolitre elüsyon toplayın. Kalan elüasyonu yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. RNA ayıklamak için, RIPiT elution için RNase içermeyen su ve fenol-kloroform isoamyl alkol 400 mikrolitre 320 mikrolitre ekleyin.
Karışımı girdap ve sonra 12,000 g beş dakika santrifüj. Ayrı bir tüp içine sulu faz 350 mikrolitre toplayın. Toplanan numuneye sodyum asetat, magnezyum klorür, glikojen ve etanol ekleyin ve karışımı bir gecede negatif 20 santigrat derecede inkübün.
Ertesi gün, pelet RNA santrifüj tarafından 12, 000 g 30 dakika için 4 derece santigrat ve% 70 etanol içinde yıkayın. Etanol yıkadıktan sonra, RNA'yı Herhangi bir ATP olmadan T4 polinükleotid kinaz veya PNK ile tedavi edin ve el yazması talimatlara göre fenol-kloroform saflaştırma yapın. Temiz RNA'yı 4,5 mikrolitre RNa içermeyen suda yeniden askıya alın.
RNA verimini ölçmek için, RNA'yı PNK'lı radyoetiketi ve el yazması talimatlara göre 32P etiketli ATP'ler etiketlendi. Boyut ve miktar standartları için düşük menzilli DNA merdiveni ve 20 ila 40 nükleotit sentetik oligo kullanın. Etiketli RNA'yı %26 üre-poliakrilamid jelüzerinde çözün.
El yazması talimatlara göre jeli kurutun ve yeterli sinyal algılanana kadar jeli fosfoscreen'e maruz bırakın. Bu teknik exon kavşak kompleksi veya EJC etkileşimlerini araştırmak için kullanılmıştır. RIPiT prosedüründeki her önemli adımdan arındırılı proteinlerin Batı leke analizi saflaştırılmış EJC'nin hem EIF4A3 hem de MAGOH içerdiğini göstermektedir.
Negatif kontrol, HNRNPA1, elüsyon da algılanmaz. RNA ayak izi sinyalinin gücü RNA protein etkileşimi miktarı ile ilişkilidir. RiPiT puromisin ile tedavi edilen hücrelere yapıldığında daha güçlü bir ayak izi gözlenir, bu da RNA'da EJC doluluk oranını artırır.
RIPiT'nin etkili olduğundan emin olmak için IP'nin verimliliğini batı lekelerine göre test etmek önemlidir. Ayrıca, derin sıralamaya geçmeden önce RNA'nın miktarını ve kalitesini değerlendirmek de önemlidir. 2018 yılında Singh laboratuarı bu tekniği exon bağlantı kompleksinin iki bileşimsel olarak farklı varyasyonlarını arındırmak ve RNA bağlama desenlerini tanımlamak için başarıyla kullanabilmektedir.
Araştırmacılar rna ayak izlerini otoradyografi ile tespit etmeyi seçerlerse, tüm uygun radyasyon güvenliği prosedürleri ve protokolleri izlenmelidir.
