Bu protokol, EGFP ifade eden Escherichia coli kullanarak makrofajların fagositoz yeteneğini değerlendirmek için basit ve üredüzebilir bir yöntem göstermiştir. Merhaba, benim adım Dalian Tıp Üniversitesi'nden Jun-Yu. Bugün size kolay ve iki saat içinde kolayca yapılabilecek makrofaj fagositoz değerlendirmek için yol görselleştirmek için gidiyoruz.
Bu yöntem doğuştan gelen immün fonksiyon çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır. Bu doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu yaşlılarda bozulmadan kaldı inanılmaktadır. Bugün, yaşlı ve genç farelerden periton makrofajlarını izole edeceğiz ve bu iki grubun fagositik yeteneğini göreceğiz.
Hadi başlayalım. İlk olarak, EGFP gen parçasını sentezleyin ve yüksek sadakatli Taq DNA polimeraz kullanarak parçayı klonla. Daha sonra PCR ürünlerini pET SUMO vektörüne dönüştürün.
Üçüncü olarak, e.coli suşu içine ligasyon ürünleri dönüştürmek ve laktoz ile ifade EGFP neden. Bu EGFP ifade E.coli fagositoz tofmu için belirteç olarak görev yaptı. Daha sonra, bir fare periton makrofajlar izole edildi ve kültürlü.
Daha sonra, EGFP ifade E.coli 37 santigrees bir saat makrofajlar ile coincubated edildi. Söndürme adımından sonra makrofajlar hem floresan mikroskobu hem de akış sitometresi ile değerlendirilmeye hazırdı. EGFP gen parçasını sentezleyin ve yüksek sadakatli Taq DNA polimeraz kullanarak ileri ve ters astarlarla parçayı yükseltin.
PCR ürünlerinin bir sonraki adımda TA klonlama için tek üç uçlu adenin çıkıntılara sahip olduğundan emin olmak için, son döngüden sonra 72 santigrat derecede 30 dakikalık bir uzatma önerilir. AGAROSE jel elektroforez ile PCR ürün kontrol edin. Eğer parça doğru bir şekilde güçlendirilmişse, jel üzerinde 717 bp bandı gözlemlenebilir.
T4 DNA ligaz ile TA klonlama yöntemini kullanarak PCR ürünlerini pET SUMO vektörüne kopyala. Reaksiyonu oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. BL21 yetkili hücrelerin 100 mikrolitre içine PCR ürün beş mikrolitre ekleyin.
Isı hücreleri 42 derecede 90 saniye boyunca şok eder, sonra karışımı üç dakika buzda tutar. Lb orta 400 mikrolitre ekleyin, önceden ısıtılmış 37 santimetre centigrees. 37 derece centigrees ve 120 rpm bir saat sallayarak.
Vektöre dönüştürülmüş E.coli'yi taramak için bakterileri mililitre kanamisin başına 100 mikrogram ile LB plakayüzeyine aşılayın. Tabağı bir gecede 37 derece lik fırında kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, mililitre kanamisin başına 100 mikrogram ile LB medya beş mililitre içine pozitif bir koloni aşılamak.
37 derece centigrees iki saat boyunca 120 rpm inkübatör sallayarak kuluçka. Sonra litre başına 0.5 milimol son konsantrasyonuna indükleyici laktoz ekleyin ve altı saat sallayarak devam, EGFP ifade indükleyen. Ampirik olarak, altı saat sallayarak, OD600 0.7 veya daha yüksek ulaşabilir.
Son olarak, EGFP ifade ölçüde doğrulamak için floresan mikroskop kullanarak. Bir slayt için bakteri kültürü orta 10 mikrolitre ekleyin. Sonra bir kapak fişi ile kaplayın.
Floresan mikroskobu altında EGFP ifadesini inceleyin. 100 mililitre distile suya 3,5 gram tiyoglikolat ekleyin. Kullanmadan önce otoklavda sterilize edin.
Tioglikolat ortasını kaputtaki bir mililitrelik steril şırıngaya aspire edin. Enfeksiyonönlemek için şırınga başına bir fare. Fare periton boşluğuna 23 kalibrelik bir iğne kullanarak bir mililitre 3,5 tioglikolat ortası enjekte edin ve fareyi üç gün boyunca su ve gıda reklamı libitum ile koruyun.
Üç gün sonra, hızlı bir şekilde kapalı bir kutuiçinde sevofluran e-posta ile anestezi indükledikten sonra servikal çıkış ile fare ötenazi. Sonra, steril ve hızlı bir şekilde kaputa aktarmak için% 75 etanol ile bir çanak içine fare koyun. Fareyi plakaya yerleştirin ve farenin konumunu düzeltmek için ön pençeyi tahtaya sabitle.
20-gauge iğne ile beş mililitrelik şırınga kullanarak, fare periton boşluğuna alt karın soğuk PBS beş mililitre enjekte, bağırsak delinme kaçınarak. Fare karnının iki tarafına hafifçe masaj yapın. Sonra yavaşça ve yavaşça karın sıvısı aspire.
Periton sıvısını 50 mililitrelik bir santimetrelik tüpe dağıtın. Bu adımları iki veya üç kez tekrarlayın. Askıda hücreleri 4-8 santigrat derece400 g 10 dakika santrifüj.
Supernatant atın ve% 10 fetal sığır serumu ile RPMI 1640 orta hücre pelet resuspend. Akış sitometri sitometri satometri satomu ve floresan mikroskobu için 24 iyi plaka içine iyi başına 500.000 hücre için altı iyi plaka her kuyuya beş milyon hücre ekleyin. Kültür hücreleri 37 derecede bir gecede %5 karbondioksit kuvözde.
Bunların çoğu lenfositler olduğu için kültür ortamı nonadherent hücreleri kaldırmak için üç saat sonra yenilenebilir. Hücre canlılığını ve hücre yoğunluğunu değerlendirmek için hücreleri parlak alan mikroskobu altında gözlemleyin. Burada gösterilen görüntü birincil hücrenin normal durumundaydı.
Periton hücrelerinin büyük bir kısmı lenfositler olduğu için genellikle makrofaj hücre yoğunluğu yüksek değildi. Kültür ortamını 24 kuyulu plakadan çıkarın. Taze kültür orta 100 mikrolitre ve bakteriyel orta 10 mikrolitre ekleyin.
Sonra plakayı 37 derecede bir saat boyunca %5 karbondioksit kuvözde kuluçkaya yatırın. İçselleştirilmeyen bakterileri temizlemek için her kuyuda 500 mikrolitre soğuk PBS ile 3-5 kez hafifçe yıkayın. Hücreleri PBS'de %4 formaldehit ile oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. F-aktin lekepoid 633 eşleyolnize çalışma solüsyonu ekleyin. 60 dakika oda sıcaklığında karanlık ve nemli bir yerde saklayın.
Hücre nükleer leke VE oda sıcaklığında karanlık bir yerde beş dakika kuluçka IÇIN DAPI çalışma solüsyonu ekleyin. Bir kez PBS ile durulayın ve bir kez distile suda aynı hacimde. Yeşil renkte görüntülenen EGFP ifade eden E.coli fagositozun belirteci olarak görev yaptı.
Deneysel hataları en aza indirmek ve sonuçların doğru yorumlanmasını sağlamak için, tablo 2'de listelenen deney için gruplar ve kontrol tüpleri ayarlayın. Buzun üzerine yerleştirilecek kontrol grubu için, ortayı altı kuyulu plakadan çıkarın ve bir kez PBS ile yıkayın. Sonra hücre ayırmak ve akış sitometri tüpü içine aktarmak için kuyuiçine litre soğuk EDTA bir mililitre başına 70 milimole ekleyin.
Tüpiçine 50 mikrolitre bakteriyel süspansiyon ekleyin ve bir saat boyunca buzun üzerine yerleştirin. Diğer gruplar için, kültür ortamı kaldırmak, her kuyuya bir mililitre taze orta ekleyin. Tablo ikide açıklandığı gibi grup ayarına göre kuyulara 50 mikrolitre bakteri süspansiyonu ekleyin.
Sonra bir saat için 37 derece centigrees% 5 karbondioksit inkübatör altı iyi plaka yerleştirin. İçselleştirilmeyen E.coli floresansını gidermek için, kuyuya 200 mikrolitre %0,8 kristal menekşe su çözeltisi ekleyin ve kısa bir süre sallayın. Bu adım, makrofajların yüzeyine bağlanan ancak içselleştirilen EGFP E.coli tarafından yanlış pozitif sonuçları önlemek amacıyla tasarlanmıştır.
Herhangi bir kalıntı kristal menekşe kaldırmak için PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Sonra hücre ayırmak ve akış sitometri tüpü içine aktarmak için kuyuiçine litre soğuk EDTA bir mililitre başına 70 milimole ekleyin. Tüpleri santrifüj 2, 000 rpm beş dakika ve supernatant atın.
Hücreleri yeniden askıya almak için 100 mikrolitre PBS ekleyin. Grup ayarına göre tüplere veya isotiplere beş mikrolitre F4 ATP konjuge antikor ekleyin. Girdap kısaca ve karanlıkta 5 ila 10 dakika buz üzerinde örnekleri kuluçka.
Her tüp ve santrifüj içine bir mililitre PBS ekleyin 2, 000 rpm beş dakika. Supernatant atın. Akış sitometri analizi için 200 ila 300 mikrolitre PBS ile hücre peletlerini yeniden askıya alın.
Her tüpü çalıştırın ve F4/80 pozitif hücrelerin en az 10.000 olayı için veri elde edin. Burada genç ve yaşlı gruplardan periton makrofajlar floresan görüntüleri vardır. Kırmızı floresan F-aktin'i temsil eder.
Yeşil, EGFP ifade eden E.coli'yi, mavi ise DAPI tarafından boyanmış çekirdeği temsil eder. Bu görüntüler, genç fareden gelen makrofajların yaşlı fareden daha güçlü fagositik bir yeteneğe sahip olduğunu göstermektedir. F4/80-pozitif ve EGFP pozitif hücreler makrofajların fagositik yeteneğini gösterdi.
Bu sonuçlar floresan mikroskop sonuçları nın eğilimi ile tutarlıdır. Doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin sayısı yaşlı farede korunsa da fagositik yetenek genç fareye göre önemli ölçüde azaldı. Makrofaj fagositözün değerlendirilmesinde birçok yöntem kullanılmıştır.
Burada uygun, hızlı ve ekonomik açıdan uygun geliştirilmiş bir yöntem gösteriyoruz. EGFP ifade eden E.coli ile fagositoz tetkik, araştırmacının tercihlerine göre hem akış sitometresi hem de floresan mikroskop ile kolayca yapılabilir ve ölçülebilir. Ayrıca bu yöntem doğrudan fagositik yeteneğini ölçer.
Sonuçlar diğer dolaylı yöntemlere göre daha çoğaltılabilir.
