Bu protokol, birden fazla PtM'nin antikorlarla eşzamanlı olarak zenginleştirilmesi ve ardından veri bağımsız toplama kütle spektrometresi analizinin site lokalizasyonu ve çapraz konuşma hakkında biyolojik bir içgörü elde etmek için yeni tekniği açıklamaktadır. Bu, peptidlerin asetilasyon ve süksinyon PtM'leri içeren dilimleme ile sadece az miktarda numune girişi ile eşzamanlı olarak tanımlanmasını ve nicelemesini sağlayan bir zaman ve uygun maliyetli tekniktir. Çeviri sonrası değişikliklerin izlenmesi, farklı hastalık durumlarını karakterize etme ve bunlarla mücadelede önemli bir adımdır.
Bazı kanserlerin ve şeker hastalığının bu protein modifikasyonları ile yüksek oranda düzenlendiğinin farkındayız. Bu yöntem teorik olarak her yerde zenginleşme, fosforilasyon ve diğerleri gibi antikorları olan PtM'ler için geçerli olabilir. Ayrıca diğer doku tipleri veya hücre kültürü modelleri için geçerli olabilir.
Bu tekniği kullanarak değerli veri elde etmek için anahtar tekrarlanabilirlik olduğunu. Bu, tüm adımların özellikle antikor boncukları içeren adımlarda çok dikkatli bir şekilde yapılmasını sağlayarak elde edilebilir. Başlamak için, 10 miligrama kadar proteini birleştiren C18 resin içeren kartuşlar elde edin.
Bu kartuşları bir vakum aparatına sığdırın. Kartuşlara %19,8 su ile 800 mikrolitre asetonitril ve %0,2 formik asit ekleyin ve sıvıyı çekmek için vakum emmeye başlayın. Kartuşların tamamen kurumasını önleyerek bu adımı bir kez tekrarlayın.
Vakum emme ile suya %0,2 formik asit 800 mikrolitre ekleyerek kartuşları dengeleyin. Bunu iki kez tekrarlayın. Vakum emme ile kartuşları üzerine yaklaşık 1.000 mikrolitre çözelti bir miligram peptidler yükleyin.
Vakum emme altında suda% 0.2 formik asit 800 mikrolitre ile iki kez peptidler yıkayın. Sonra peptid toplamak için her kartuş altında 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpler idüzenleyin. Vakum emme altında, kartuşlardan gelen eute peptidler önce 800 mikrolitre %80 asetonitril ve %0,2 formik asit %19,8 suda, sonra aynı çözeltinin 400 mikrolitresi ile.
Tuzsuz peptid örneklerini 2-3 saat boyunca vakumlu konsantratöründe tamamen kurutun. Şimdi, soğuk 1X immünafinit arıtma tampon 1.4 mililitre kurutulmuş peptidler resuspend. Girdap karıştırmak ve yaklaşık 7 bir pH sağlamak.
Numuneleri 10,000 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Küçük bir pelet belirir. Antikor boncuk hazırlarken buz üzerinde bir kenara peptidler ayarlayın.
100 mikrolitre K-asetil antikor boncuk bulamacı ve 100 mikrolitre K-succinyl antikor boncuk bulamacı içeren bir tüp içeren bir tüpe bir mililitre soğuk 1X PBS ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Tüm çözeltiyi yeni 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca minyatür bir santrifüjde döndürün. Herhangi bir boncuk kapalı aspirating önlemek için özen PBS aspire.
Yıkamayı üç kez daha tekrarlayın. Sonra, PBS yaklaşık 440 mikrolitre boncuk resuspend. Pipet boncuklar birkaç kez iyi karıştırmak için.
200 mikrolitre precut ipuçları ile, transfer 100 her asetilizin antikor boncuk ve süksinillyin antikor boncuklar yeni bir tüp içine mikrolitre. Minyatür bir santrifüj de 30 saniye boyunca aşağı spin ve bir jel yükleyici ucu ile medya kapalı aspire. Boncuklar şimdi beyaza dönüyor.
Pipet yıkanmış boncuklar üzerine doğrudan resuspended peptid ve ajitasyon ile bir gecede dört derece santigrat boncuk ile peptidler kuluçka. Sabahları, peptit örneklerini 2,000 kez g'de 30 saniye boyunca 4 santigrat derecede döndürün. Bağlı olmayan peptidler içeren supernatant çıkarın ve istenirse gelecekteki deneyler için kaydedin.
Beş kez ters çevirerek yıkamak ve karıştırmak için boncuklar soğuk 1X immünafinitasyon arınma tampon bir mililitre ekleyin. 2,000 kez g'de 30 saniye boyunca 4 santigrat derecede dön. İmmünafinite saflaştırma solüsyonunu aspire edin ve immünafinitasyon yıkama yıkayın adım ını bir kez daha tekrarlayın.
Sonra boncuksoğuk HPLC su bir mililitre ekleyin ve beş kez ters çevirerek karıştırın. 2,000 kez g'de 30 saniye boyunca 4 santigrat derecede dön. Su aspire ve su yıkama adımı iki kez daha tekrarlayın.
Tüpün altında kalan suyu toplamak için 4 santigrat derecede 30 saniye boyunca 2,000 kez g'de ek bir süre döndürün. Düz uçlu jel yükleme ipuçları ile, toplanan herhangi bir ekstra su kapalı aspire. Boncuklar aspirating önlemek için dikkatli olun.
Boncuklara suya 55 mikrolitre %0.15 trifloroasetik asit ekleyin. Bazen karıştırmak için tüpün altına dokunarak oda sıcaklığında 10 dakika boyunca boncuk kuluçka. Minyatür bir santrifüj içinde 30 saniye boyunca oda sıcaklığında boncuk spin.
Yeni bir tüp içine eluted peptidler aktarmak için düz uçlu jel yükleme ucu kullanın. Boncuklara suya %0,15 trifloroasetik asit 45 mikrolitre ekleyin. Zaman zaman karıştırmak için tüpün altına dokunarak oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
Minyatür santrifüj de 30 saniye boyunca oda sıcaklığında boncuk spin. Düz uçlu jel yükleme ucu kullanarak ikinci elüasyonu çıkarın ve ilk elution ile birleştirin. Üzerinde taşıyan boncukları peletlemek için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 12, 000 kez g'de kombine eluted peptidleri döndürün.
Peptit numune solüsyonunu yeni bir 500 mikrolitrelik tüpe aktarın. Zenginleştirilmiş peptit karışımlarını C18 ön kolon çipine yüklemek için yükleme yöntemini oluşturun ve 10 dakika boyunca dakikada iki mikrolitrede a fazı ile yıkayarak peptidleri tekrar tuzdan arındırın. Peptitler analitik bir kolona aktarılır ve dakikada 300 nanolitre lik bir akış hızıyla, A ve B.Özellikle mobil faza göre %5 mobil faz B'den %35 mobil faz B'ye kadar doğrusal bir degrade kullanın.
Daha sonra, mobil B fazını beş dakika içinde %80'e rampalayın ve 25 dakikalık bir yeniden dengeleme için %5 B'ye dönmeden önce sekiz dakika boyunca %80 B'de tutun. Ardından, veribağımlı edinme için bir MS enstrüman yöntemi oluşturun. Deney için, Ms1 öncül iyon tonu'nun M/Z 400'den 1,500'e ayarla.
Süreyi 120 dakika olarak ayarlayın. Bir IDA denemesi oluşturun ve Tamam'ı tıklatın. Geçiş ölçütleri sekmesinde, saniyede iki ila beş ila 200 arasında yüklü durumların iyonları için MS/MS taramalarını tetiklemek için yoğunluk eşiğini ayarlayın. Öncül iyonların dinamik dışlanmasını 60 saniyeye ayarlayın.
İkinci deneme için MS/MS ürün iyonu tonu,M2 100 ile 1, 500 arasında MS2 tarar. Parametreleri tıklatın ve çarpışma enerjisi beş e yayMak ayarlayın ve yüksek duyarlılık ürün iyon ton modunu seçin. Son olarak, örneği otoörnekleyiciye yerleştirin.
Örnek sırayı gönderin ve veri bağımsız edinme için bir MS enstrüman yöntemi oluşturma ve iki enstrüman tarası deneyi tanımlama lc-MS/MS edinme yöntemlerini başlatın. 400 ile 1, 250 kütle arasında MS1 öncül iyon taramaları gerçekleştirin ve süreyi 120 dakikaya ayarlayın. Çarpışma enerjisinin 10'a ve birikim süresini 45 milisaniyeye ayarlayın ve ardından yüksek hassasiyetli ürün iyon tonu modunu seçin.
Ardından, SWATH edinme pencerelerini yönteme doldurmak için 64 değişken pencere DIA SWATH edinme düzenini içeren bir metin dosyası içe aktarın. Bu satın alma şemasında, şarj ve genişlik için beş ila 90 kütle arasında değişen değişken pencereler 400 ila 1, 250 kütle nin tam kütle aralığında her biri 45 milisaniyelik birikim süresine sahip toplam 64 SWATH segmenti ile şarj etmek için artımlı adımlarla geçirilir. MS1 birikim süresini 0,25 saniyeye ayarlayın.
Birlikte, MS1 taraması ve 64 MS2 taramaları şimdi 3,2 saniye toplam çevrim süresi vermelidir. Bu çalışmada, deneysel sonuçlar PTM çapraz konuşma tespit ve değerlendirme olasılığını belgelenmiştir. Bu tablo, iş akışının zaman çizelgesini ve gerekli numune ve protein miktarlarını gösterir.
Tek pot yöntemi bu alternatif yöntemlerin yarısı kadar ve yarım örnek sayısı ile yapılabilir. Modifiye peptid alanları için ortalama varyasyon katsayısı tek pot yönteminde tek PTM ve seri PTM zenginleştirme daha düşüktü. Tek potluk PTM ve tek PTM zenginleştirme yöntemleri karşılaştırırken, iki değişiklik için site düzeyinde nicelik korelasyonları arasında kayda değer bir fark yoktu.
Bu şekil, başarılı bir zenginleştirmeden elde edilen verileri görüntüler ve PTM çapraz konuşma görselleştiren birden fazla ve farklı asil değişiklikler içeren bir peptid için bir örnek göstermektedir. Bir lisin kalıntısı üzerinde bir peptit asetillenmiş ve diğerinde sükse lenmiş, burada ise aynı peptid her iki lizinde de sükse edilmiş. Bu, aynı lizin kalıntısının her iki aylasiyon grubuyla da değiştirilebilen ibaratede olabileceğini ve o bölgede çapraz konuşma olasılığı olduğunu göstermektedir.
Her numunenin aynı miktarda boncuk içerdiğinden emin olmak ve peptid bağ boncuklarını yıkarken boncukların hiçbirinin kazara aspire edilmemesini sağlamak önemlidir. Spectronaut gibi yazılım araçlarında kütle spektrometresi tabanlı profil oluşturma ve veri analizi, PtM'lerin site lokalizasyonunu belirlemek, ölçmek ve gerçekleştirmek için bu yordamı izleyerek gerçekleştirilir. Eşzamanlı PTM zenginleştirme ile birlikte bu veri bağımsız satın alma iş akışı daha verimli PTM çapraz konuşma değerlendirmek ve PTM sinyal alaka daha iyi anlayışlar sağlamak için yollar açacaktır.
