Bu protokol, spesifik tanımlanmış proteinleri tanımlayarak ve yarı nicelleştirerek ubiquitin ve ubiquitin benzeri post-translational modifikasyonların profillerini oluşturmanın kolay bir yoludur. Bu tekniğin en büyük avantajı, lentivirüslerin bir hafta içinde kararlı bir ifade hücresi hattı oluşturmak için kullanılması ve proteinleri özel olarak arındırmak için iki etiket in kullanılmasıdır. Aslında, bu tür post-çevirisel değişiklikler çoğu biyolojik fonksiyonlarda yer alır ve bu mekanizmanın değişiklikleri çoğu hastalıkta bulunur.
Bu nedenle, bu değişikliklerin belirlenmesi prognostik ve/veya tanı ve tabii ki moleküler hedefler olarak kullanılabilir. Ubiquitin ökaryotik hücrelerde en korunmuş protein biridir ve bu onların hayatta kalmak için gerekli. Bu nedenle, bu tür bir yöntem memelilerden mayaya kadar her ökaryotik modele uygulanabilir.
Ancak, bizim lentiviral sistem hücrelerin çalışma ile sınırlıdır. Tüm işlem bazen uzun kuluçka süresi ile oldukça uzun olduğundan, bir yerine iki gün içinde bunu yapmak mümkündür. Nikel boncuklardan elde edilen ler eksi 20'de ve Bayrak boncuklarını eklemeden önce dondurulabilir.
Bu protokol, arınmanın nihai başarısını garanti altına almak ve böylece çeviri sonrası modifikasyon profilinin doğru kurulmasını garanti etmek için aralarında bazılarının kritik olduğu birçok adım içerir. Prosedürün gösterilmesi mirna Swayden ve Aurelie Dobric, laboratuvar iki doktora öğrencileri tarafından yapılacaktır. Başlamak için, tohuma% 10 FBS ile DMEM kuyusu başına iki mililitre ile altı iyi bir plaka HEK 293T hücrelerinin altıncı 0,5 kez 10 ekleyin ve 37 derece santigrat, % 5 karbondioksit ve% 100 nem kuluçka.
Ertesi gün, 50-70% biraraya elde edilir. Kolör hücreleri pCCL-6HF ubiquitin benzeri veya pCCL-GFP bir mikrogram, PBS VG bir mikrogram ve lentivirus üretimi için bir transfeksiyon reaktifi ve protokol kullanarak delta yardımcı vektörlerin bir mikrogram karışımı ile hücreleri. Altı saatlik transfeksiyondan sonra, ortamı, transekedilecek hücrelerin ortamına karşılık gelen yeni bir ortama dönüştürün.
%10-20'lik bir gün birleşimini elde etmek için, standart kültür ortamları ile altı kuyulu bir plaka içinde geçirilecek hücreleri tohumlayın. Transfeksiyondan 24 saat sonra, merceksi viral partiküller içeren ortamı geri alın ve 0,45 mikronfiltre kullanarak filtre uygulayın. Lentivirüsler içeren filtrelenmiş ortam tarafından transe edilecek hücrelerin orta sını değiştirin.
Hücreleri 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le bir kuluçka makinesinde 24 ila 72 saat boyunca lentivirüslerle kuluçkaya yatırın ve sonra ortamı taze, standart bir maddeyle değiştirin. Transdüksiyonun verimliliğini değerlendirmek için ters floresan mikroskop kullanarak GFP ifadesini kontrol edin. Floresan algılanmamışsa, iki ila üç gün daha bekleyin.
GFP kontrolü yeşil floresan ile pozitif ise, burada gösterildiği gibi, immünofloresan tarafından 6-His-FLAG ubiquitin gibi bir ifade kontrolü gerçekleştirmek için yeterli olana kadar tüm hücreleri büyümek, ve batı leke anti-FLAG antikor kullanarak. Hücreleri 15 santimetrelik tabaklarda büyüttükten sonra, kültür yemeklerini en az bir kez oda sıcaklığında fosfat tamponlu tuzlu ile yıkayın. Hücre lisis başlamak için, oda sıcaklığında her 15 santimetrelik çanak içine tampon bir iki mililitre ekleyin.
50 mililitrelik konik santrifüj tüpler içine tüm lysates kurtarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. 30 saniye boyunca üç kez listates sonicate, bir dakikalık bir duraklama ile ayrılmış. 15 dakika boyunca 15, 000 kez g sonicated lysates santrifüj.
Süpernatantı 40 mikronluk bir süzgeçle yeni bir tüpe aktarın. Sonication ve santrifüj den sonra lysates filtre lemek çok önemlidir. Bunu yapmamak birçok spesifik olmayan proteinin saflaştırılmasına neden olabilir, böylece arka planı artırabilir ve PTM profilinin boyutunu güçlü bir şekilde azaltabilir.
50 ile 100 miligram arasında eşit miktarda proteini yeni Falcon tüplerine aktarın. Protein bir miligram başına boncuk iki mikrolitre miktarı ile her tüp içine nikel iyon NTA boncuk ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında 2,5 saat boyunca 30 rpm'de döndürmek için bir rotator üzerine yerleştirin.
Sonra boncukları 5dakika boyunca 500 kez g'ye alın. Boncukları bir mililitre tampon tüple yıkayın ve numuneleri 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü buza yerleştirin.
On milimolar imidazol içeren bir mililitre buz gibi tampon iki ile iki kez yıkayın. Elute bağlı proteinler için, tampon iki 250 milimolar imidazol içeren 600 mikrolitre ekleyin ve dört santigrat derece iki saat döndürün. Bir dakika için 500 kez g santrifüj ile boncuk peletleme sonra, yeni bir önceden soğutulmuş 1.5 mililitretüp supernatant aktarın ve anti-FLAG M2 antikor konjuge boncuk 50 mikrolitre ekleyin.
4 santigrat derecede 2,5 saat boyunca 30 rpm'de döndürün. Sonra tampon iki 500 mikrolitre ile iki kez yıkayın, sonra tampon üç 500 mikrolitre ile iki kez. Son elüsyon için, mikrolitre başına 0,01 mikrogram da FLAG peptid içeren tampon üç 100 mikrolitre ekleyin ve 1 1/2 saat boyunca dört santigrat derecede döndürün.
Bir dakika için 500 kez g santrifüj sonra, yeni bir önceden soğutulmuş tüp için supernatant aktarın. SDS-PAGE'e yüklemek için 10 mikrolitre alın ve arıtma kalitesini kontrol etmek için jelin gümüş boyamasını gerçekleştirin. Arınma iyi görünüyorsa, LC-MS tarafından bırakılan %90'ı analiz edin.
Normalleştirme gerçekleştirmek için, ubiquitin ve GFP için ilaç tedavi hücreleri ve tedavi edilmemiş hücreler arasındaki değerleri normalleştirmek için formülleri kullanın. Arka planı kaldırmak için, her iki durumda da tanımlanan her protein için belirli değerler elde etmek için, kontrol numunesi GFP değerlerini ubikitin örneklemlerinde değerlerden çıkarın. Her yerde bulunan varyasyonu elde etmek için, bir ilaç tarafından indüklenen PtM'lerin pozitif ve negatif varyasyonları için eksi 100 ile artı 100 arasında bir puan alın.
İşlenen ve işlenmemiş örneklerin belirli değerleri arasındaki fark, kontroldekiler de dahil olmak üzere tüm değerlerin toplamına bölünür ve 100 ile çarpılır. PTM'nin baskıyı temsil eden eksi 50'nin altındaki veya PTM'nin indüksiyonuna neden olan 50'nin üzerindeki varyasyonlar anlamlı kabul edilir. 50'nin üzerindeki sıfır ve %100 değerleri arasında bir güven değeri elde etmek için bu formülü kullanın genellikle emin olarak kabul edilir.
İndüksiyon ve bastırma değerlerinin daha güzel bir dağılımını elde etmek ve hem varyasyon hem de güven parametrelerini göz önünde bulundurmak için varyans ve güven değerlerini çarpmak için bu formülü kullanın. Bu çalışmada, kültür memeli hücrelerinin transdüksiyonu GFP ve 6-histidin FLAG ubiquitin ifade hücreleri oluşturmak için elde edilmiştir. Lentiviral transdüksiyonun etkinliği ilk olarak GFP'ye bağlı hücrelerin GFP floresansı inceleyerek kontrol edildi.
FLAG-ubikitin ekspresyonu, transekte hücrelerin yüzdesini gösteren bir anti-FLAG antikor kullanılarak immünoresans boyama ile yapıldı. Eksojen FLAG-ubiquitin ekspresyon düzeyini kontrol etmek için transeksed hücrelerden lysates SDS-PAGE tarafından analiz edildi ve ardından anti-FLAG antikorlu batı lekesi incelendi. Her yerde bulunan proteinlerin saflaştırılmasından sonra, son elüsyonun %10'u SDS-PAGE ve jelin gümüş boyama sıyrıklarının miktarını ve bütünlüğünü kontrol etmek için kullanılmıştır.
Arka plan GFP örnek çıkarma tespit 364 proteinler önemli ölçüde üzerinde bir skor ile her yerde 50%A gen seti zenginleştirme analizi bu ubikitinated proteinlerin dahil oldukları biyolojik süreçleri vurgulamak için yapılmıştır. Her yerde gemsitaten indüklenen değişikliklerden oluşan potansiyel etkileşim ağları. Bu, ilgili proteinlerin artmış veya azalmış her yerde bulunan etkilerinden güçlü bir şekilde etkilenen işlevsel etkileşim ağlarının tanımlanmasına yol açmıştır.
Ayrıca gemsitain tedavisinden sonra PCNA'nın her yerde arttığı doğrulandı. Her iki elution adımından sonra bazı boncukların aktarılmasını önlemek çok önemlidir, çünkü arka planda önemli bir artışa neden olabilir. Bu yordam, farklı koşulları karşılaştırarak, belirli değişikliklerin tanımlanmasını sağlayacak belirli çeviri sonrası değişiklikler üretecektir.
İlk sonraki adım biyokimyasal yaklaşımlara dayalı ilgi değişiklikleri en azından doğrulamak olacaktır. Biz pankreas kanseri hücrelerinin yeni yolları ve mekanizmaları belirlemek için ubiquitin tabanlı, post-çevirisel değişiklikler keşfetmek için bu yöntemi geliştirdi. Bu protokol ve dünya çapında geliştirilen diğer yana farklı biyolojik süreçleri deşifre etmek için başarıyla istihdam edilmiştir.
Lentivirüsler en azından BL-2 laboratuvarında kullanılmalıdır. Guanidin güçlü bir denaturing ajanıdır ve dikkatli kullanılmalıdır. Sonicator da kulaklar için zararlı olabilir ve aşağıdaki öneriler in kullanılması gerekir.
