Этот протокол описывает новый метод одновременного обогащения нескольких ПТМ с антителами с последующим независимым анализом масс-спектрометрии получения данных для получения биологического понимания локализации сайта и перекрестного разговора. Это временная и экономически эффективная методика, которая позволяет одновременно идентифицировать и количественно идентифицировать пептиды с нарезкой, содержащей ацетилирование и сукчинилирование ПТМ с небольшим количеством вводимых образцов. Отслеживание пост-трансляционных модификаций является важным шагом в характеристике и борьбе с различными состояниями болезней.
Мы уже знаем, что некоторые виды рака и диабета строго регулируются с помощью этих белковых модификаций. Теоретически этот метод может применяться к любым ПТМ с антителами для обогащения, такими как убиквитинация, фосфорилирование и другие. Он также может применяться к другим типам тканей или моделей клеточной культуры.
Ключом к получению ценных данных с помощью этого метода является воспроизводимость. Это может быть достигнуто путем обеспечения всех шагов выполняются очень тщательно, особенно шаги, связанные с антителами бисера. Для начала получить картриджи, содержащие смолу C18, которые в сочетании до 10 миллиграммов белка.
Приготовь эти картриджи в вакуумный аппарат. Добавьте 800 микролитров 80%ацетонитрила и 0,2% кремовой кислоты к картриджам с 19,8%водой и начните вакуумный всасывание, чтобы вытащить жидкость. Повторите этот шаг один раз, избегая сушки картриджей полностью.
Equilibrate картриджи, добавив 800 микролитров 0,2% formic кислоты в воде с вакуумным всасыванием. Повторите это дважды. Загрузите один миллиграмм пептидов примерно в 1000 растворе микролитра на картриджи с вакуумным всасыванием.
Вымойте пептиды дважды с 800 микролитров 0,2% formic кислоты в воде под вакуумным всасыванием. Затем расположить 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки под каждым картриджем для сбора пептида. Под вакуумным всасыванием, elute пептиды от картриджей сперва с 800 microliters 80%acetonitrile и 0.2%formic кислоты в 19.8%water после этого с 400 microliters такого же решения.
Высушите опресненные образцы пептида полностью в вакуумном концентраторе в течение двух-трех часов. Теперь, resuspend высушенные пептиды в 1.4 миллилитров холодного буфера очистки иммуноаффинита 1X. Vortex смешивать и обеспечивать рН примерно 7.
Центрифуга образцов при 10 000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Появляется небольшая гранула. Установите пептиды в сторону на льду при подготовке антител шарики.
Добавьте один миллилитр холодного 1X PBS в трубку, содержащую 100 микролитров навоза K-ацетил-антитела и трубку, содержащую 100 микролитров навоза K-succinyl антитела и смешайте с помощью пипетки. Перенесите весь раствор на новые 1,5 миллилитровые трубки и вращайся в миниатюрной центрифуге в течение 30 секунд при комнатной температуре. Аспирировать PBS заботы, чтобы избежать аспирации от любых бусин.
Повторите стирку еще три раза. Далее, повторное распределение бисера примерно в 440 микролитров PBS. Pipette бисер несколько раз, чтобы хорошо перемешать.
С 200 microliter precut советы, передача 100 микролитров каждого ацетиллин антитела бисера и succinyllysine антитела бисера в новую трубку. Спин вниз в течение 30 секунд в миниатюрной центрифуге и аспирировать от средств массовой информации с гель погрузчик отзыв. Теперь бисер побелеть.
Pipette resuspended пептид сразу на помытые шарики и инкубировать пептиды с бисером при четырех градусах по Цельсию ночь с возбуждением. Утром, спина пептида образцов на 2000 раз г в течение 30 секунд при четырех градусах цельсия. Удалите супернатант, содержащий несъебленные пептиды и при желании сохраните для будущих экспериментов.
Добавьте один миллилитр холодного буфера очистки иммуноаффинита 1X к бисеру, чтобы вымыть и перемешать, инвертировать пять раз. Спин при 2000 раз г в течение 30 секунд при четырех градусах цельсия. Аспирировать от раствора очистки иммуноаффинита и повторить иммуноафиниты очистки мыть шаг еще раз.
Затем добавьте один миллилитр холодной воды HPLC в бисер и перемешайте пять раз. Спин при 2000 раз г в течение 30 секунд при четырех градусах цельсия. Аспирировать от воды и повторить шаг мытья воды два дополнительных раза.
Спин дополнительное время на 2000 раз г в течение 30 секунд при четырех градусах по Цельсию, чтобы собрать оставшиеся воды в нижней части трубки. С плоским наконечником гель загрузки советы, аспирировать от любой дополнительной воды, которые собрали. Будьте осторожны, чтобы избежать аспирации бисера.
Добавьте в бисер 55 микролитров 0,15%трифтороацетической кислоты в воде. Инкубировать бисер в течение 10 минут при комнатной температуре, а иногда нажав нижней части трубки, чтобы смешать. Спин бисер при комнатной температуре в течение 30 секунд в миниатюрной центрифуге.
Используйте плоский наконечником гель погрузки отзыв для передачи элализованных пептидов в новую трубку. Добавьте в бисер 45 микролитров 0,15%трифтороацетической кислоты в воде. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре при нажатии нижней части трубки время от времени смешивать.
Закрути шарики при комнатной температуре в течение 30 секунд в миниатюрной центрифуге. Удалите второй элюция с помощью плоского наконечника гель загрузки кончика и объединить его с первым elution. Спин комбинированных элайт пептидов на 12000 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре гранулы любые бусы, которые перенесут.
Перенесите раствор пептидного образца в новую 500 микролитровую трубку. Постройте метод загрузки для загрузки обогащенных пептидных смесей на чип C18 и снова разезвите пептиды, промыв мобильный этап А на двух микролитров в минуту в течение 10 минут. Создайте метод хроматографии таким образом, чтобы пептиды передавались в аналитическую колонку и elute со скоростью потока 300 нанолитров в минуту с двух-трехчасовым градиентом с использованием мобильных фаз A и B.Specifically, используйте линейный градиент от 5%mobile фазы B до 35%mobile фазы B в течение 80 минут.
Впоследствии, пандус мобильной фазы B до 80%в течение пяти минут, а затем провести на 80%B в течение восьми минут, прежде чем вернуться к 5%B для 25-минутного повторного эквилибрации. Затем создайте метод MS-инструмента для получения данных. Для эксперимента один, настроить MS1 ионные сканирования прекурсоров от М / З 400 до 1500.
Установите продолжительность до 120 минут. Создайте эксперимент МАР и нажмите OK. В соответствии с вкладкой критериев коммутатора установите порог интенсивности для запуска сканирования MS/MS для ионов заряженных состояний от двух до пяти до 200 считых пунктов в секунду. Установите динамическое исключение ионов-прекурсоров до 60 секунд.
Для эксперимента два, установить MS / MS продукт ион сканирования с MS2 сканирования диапазоне от М / З 100 до 1500. Нажмите параметры редактирования и установите энергию столкновения, распространяемую до пяти, и выберите режим иона продукта высокой чувствительности. Наконец, поместите образец в автоамплеер.
Отправить образец очереди и начать LC-MS / MS методы приобретения построения MS инструмент метод для передачи данных независимого приобретения и определения двух экспериментов сканирования инструментов. Выполните сканирование ионов-предшественников MS1 от 400 до 1 250 масс для зарядки и установите продолжительность до 120 минут. Установите энергию столкновения до 10 и время накопления до 45 миллисекунд, затем выберите режим иона продукта высокой чувствительности.
Затем импортировать текстовый файл, содержащий схему приобретения 64 переменного окна DIA SWATH для заполнения окон приобретения SWATH в методе. В этой схеме приобретения переменные окна от пяти до 90 масс для зарядки и ширины передаются поэтапно по всей массе от 400 до 1 250 масс для зарядки в общей сложности 64 сегмента SWATH каждый с 45 миллисекундным временем накопления. Отрегулируйте время накопления MS1 до 0,25 секунды.
Вместе сканирование MS1 и 64 сканирования MS2 теперь должны дать общее время цикла 3,2 секунды. В этом исследовании экспериментальные результаты задокументировали возможность обнаружения и оценки перекрестного разговора PTM. В этой таблице показано, как сроки рабочего процесса и количество образца и белка требуется.
Метод «один горшок» может быть выполнен в два раза меньше времени и с половиной количества образцов, чем эти альтернативные методы. Средний коэффициент вариации для модифицированных пептидных областей был ниже в методе одного горшка, чем в одном PTM и серийном обогащении PTM. При сравнении методов обогащения pTM с одним горшком и одними методами обогащения PTM не было заметно различий между корреляциями количественной оценки уровня участка для этих двух модификаций.
Эта цифра отображает данные из успешного обогащения и иллюстрирует пример пептида, содержащего несколько и различные acyl модификации визуализации PTM кросс-говорить. Пептид был ацетилирован на одном остатке лизина и succilynated на другом в то время как здесь тот же пептид был succilynated на обоих лизинах. Это свидетельствует о том, что один и тот же остаток лизина может быть изменен с обеих групп ациляции и есть возможность перекрестного разговора происходит на этом сайте.
Важно, чтобы убедиться, что каждый образец содержит одинаковое количество бисера и убедитесь, что ни один из бисера аспирированы случайно при стирке пептидных бусин. Массовая спектрометрия на основе профилирования и анализа данных в программных средствах, таких как Spectronaut выполняются после этой процедуры для выявления, количественной оценки и выполнения локализации сайта PTMs. Этот независимый от данных рабочий процесс приобретения в сочетании с одновременным обогащением PTM откроет возможности для более эффективной оценки перекрестных разговоров PTM и даст более глубокое представление об актуальности сигнализации PTM.
