Bu protokol, TOF mikroskobu ile canlı görüntüleme kullanılarak hücre salgılanmasının nasıl araştırılabildiğini gösterir ve kümeleme olaylarını veya yüksek aktivite bölgelerini tespit etmek için araçlar sağlar. Bu protokolü kullanarak, hücre bölünmesini normalleştiren ve böylece özel salgı olayları aralıklarını kolaylaştıran mikro desen li yüzeylerde hücre kültürleri oluşturabiliriz. Hücreler bağışıklık regülasyonunda önemli rol oynayan çeşitli makromoleküller salgılarlar.
Kanserde, deregulated salgıin invazyonu kolaylaştıran proteolitik enzimlerin salınımını etkiler. Salgının nicelleştirilmesi, kanserde bozulmuş salgıyı ve antijen sunumu olan diğer dinamik süreçleri daha iyi anlamamızı sağlayacaktır. Görüntüleme ve analiz protokolümüz basit olmasına rağmen, bir mikro desen parçasıüzerinde iyi yayılan tek hücrelerin üretilmesi gerekir.
Bu videoda, mikro desen kapakları üzerindeki hücrelerin nasıl kültürlendirilebildiğini ve salgı olaylarını aralıklı istatistiksel araçlar kullanarak nasıl görselleştirilip analiz edebileceğimizi göstereceğiz. Mikro desenleme için kapaklar hazırlamak için, etanol sterilize 25 milimetre çapında cam kapakları derin ultraviyole ışık altında beş dakika aktif hale getirin. Kapaklar aktif hale getirilirken, kapak başına 30 mikrolitrelik polilizin greft polietilen glikol damlası, nemli bir oda içinde bir parafin filminin üzerine ekleyin.
Aktivasyonun sonunda, kapaklar aktif yüzey tarafını damlaların üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için nemli hazneyi kapatın. Kuluçka sonunda, kapakları iki kez distile suda yıkayın. Kapaklar kururken, bir kere de distile su ve alkol ile bir kez kuvars fotoğraf maskesi yıkayın.
Filtrelenmiş hava akışı ile fotoğraf maskesi kuru ve beş dakika boyunca derin ultraviyole ışığa kadar fotoğraf maskesi krom kaplı tarafı ortaya. Aydınlatma sonunda, her fotoğraf maskesikrom kaplı tarafına 10 mikrolitre lik su damlası ekleyin ve her bir kapak sıvısının polietilen glikol tarafını her bir damla suyun üzerine yerleştirin. Herhangi bir fazla su çıkardıktan sonra, dehidratasyon önlemek için slaytlar üzerinde bir film kapağı yerleştirin.
Kapak dudaklarını çıkarmak için fotoğraf maskelerine fazla su eklemeden önce fotoğraf maskelerinin krom kaplı olmayan kenarlarını beş dakika daha derin ultraviyole ışığa maruz bırakın. Bu adım yüzeyde mikro desen izleri üretecektir. Daha sonra bir laminar akış kaputu altında bir saat boyunca nemli bir odada parafin film üzerinde bir ekstrasellüler matris protein çözeltisi kapakları kuluçka.
Hazırlanan mikrodesen yüzeyine hücre tohumlama için, kuluçka sonunda, bir manyetik coverslip tutucu mikrodesen tarafı içine kapakları yerleştirin ve hemen coverlips desen orta ekleyin. Mührü ekledikten sonra, kapak tutucusunu ek desen ortamıyla doldurmadan önce kapak dudaklarını manyetik cihazla hareketsiz hale getirin. Sonra bir cam kapak ile tutucu kapatın.
Hücreler hazır olduğunda, transfeced immortalized retinal pigment epitel hücrelerinin 5 için 5 kat ekleyin kapakları ve hücre kültürü kuluçka 10 dakika boyunca tutucu hücreleri kuluçka. Kuluçka sonunda, bağlı olmayan hücreleri ve herhangi bir artık fetal sığır serumkaldırmak için yıkama başına taze orta ile hücreleri beş kez yıkamak için ikinci bir pipet kullanırken eski orta aspire etmek için bir pipet kullanın. Son yıkamadan sonra, tam hücre yayılmasını sağlamak için üç saat boyunca kuvöz için tutucu iade.
Eksozis olaylarını görüntülemek için, kapak tutucuyu toplam bir iç yansıma floresan mikroskobu altına yerleştirin ve tamamen yayılmış VAMP7-pHluorin'ü ifade eden bir hücre arayın. VAMP7-pHluorin eksozis olaylarının görüntülenmesine olanak tanıyan toplam iç yansıma floresan açısına ulaşınve eksoz oranı ve zaman ölçeği ile uyumlu bir frekansta beş dakikalık bir kazanım gerçekleştirene kadar lazerin açısını değiştirin. Eksoz koordinatlarını elde etmek için, Fiji'de edinilmiş eksozis olay filmini açın ve dışa doğru yayılan parlak bir sinyal görünümüyle eksozis olaylarını manuel olarak tanımlayın.
Eksoz olayının merkezini işaretlemek için nokta aracını kullanın ve x ve y-koordinatlarının yanı sıra zamansal koordinatı ölçmek için analiz ve ölçü kullanın. Bir hücrenin ölçümlerini tek bir metin dosyasına kaydedin. Metin dosyasını elektronik tabloda açın ve dilim x ve y-koordinat sütunları hariç tüm sütunları kaldırın.
Daha sonra, merkezi ve çapı ölçmek ve x ve y-koordinatları ve her hücrenin Feret çapı elde etmek için oval aracı ve ölçü kullanın. Tüm hücrelerin ölçümlerini tek bir metin dosyasına kaydedin. Metin dosyasını elektronik tabloda açın ve x ve y-koordinatı ve Feret'in çap sütunları hariç tüm sütunları kaldırın.
Sonra her hücre için yarıçap ölçümü ekleyin, sonra her hücre için Feret çapı yarıçapı elde. Her hücrenin mikro desen halkasının kalınlığını ölçmek için düz çizgi aracını kullanın. Bu ölçümü tek bir metin dosyasındaki tüm hücreler için kaydedin ve normalleştirilmiş yapışma uzunluğunu hesaplamak için yapışma uzunluğunu hücre yarıçapına bölün.
Tek hücreli uzamsal analiz için, önce RStudio paketini yükleyin ve paketi RStudio'ya yükleyin. PAKETI ESA işlevi yle çalıştırın. Bir kullanıcı arabirimi açılır, ardından veri kümesi TXT dosyalarının dizinini ve çıktı çizimlerinin dizini'ni seçer.
Komut dosyası, ilgili çizimlerin ve sayısal sonuçları içeren TXT dosyalarının PDF dosyalarını sağlayarak, otomatik olarak başlatılacaktır ve çözümleme gerçekleştirecektir. Hücre içinde, sondadaki zemin lizomun düşük pH'ı ile söndürülür, ancak ekzositoz sırasında pH proton salınımına bağlı olarak pH arttıkça sinyal vermeye başlar. PHluorin sinyali, ekzozomal protonların hızlı salınımını temsil eden ekzositoz sırasında bir tepe gösterir ve ardından plazma zarında sondanın 2D difüzyonunu temsil eden üstel sinyal bozunumu gösterir.
Tipik olarak transfect ölümsüzleştirilmiş insan retinal pigmentli epitel hücreleri ortalama 0.28 Hertz ekzositoz oranı ile önemli bir izosomal sekresyon aktivitesi gösterir. Yerel yoğunluktaki farklılıkları ortaya çıkarmak için eksozozun çekirdek yoğunluğu tahminine göre 2B dağılımını görselleştirmek mümkündür. Tam mekansal rastgelelikten üç olası sapma vardır: kümeleme, dağılım veya kümeleme ve dağılım karışımı.
Ripley'in K işlevi bu sapmaları değerlendirmek için kullanılabilir. Dikkat, yapışkan olmayan alanda eksositoz olayları da yapışma molekülleri plazma membranlarında salgı noktaları neden tek yapılar olmadığını belirten kümelenmiştir. Eksozis olaylarının histogramının temsili bir hücre için modüle göre çizilmesi, yapışkan ve yapışkan olmayan bölgeler arasındaki sınır çevresinde bir zirve yi ortaya koymaktadır.
Eşleştirilmiş analizler, adezyon alanında yüzey yoğunluğunun yapışma olmayan alana göre daha düşük olduğunu göstermektedir, potansiyel olarak hücre çevresinde eksozisozun güçlü bir şekilde azalmasınedeniyle. Hücre yapışmasının mikro desenler üzerinde istatistiksel analizle birleştirilmesi, salgı lama gibi karmaşık hücresel süreçlerin uzayda nasıl düzenlendiğini saptamayı kolaylaştırır. Salgı aktivitesinin kümeleminin altında yatan moleküler mekanizmayı belirlemek için gelecekte daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
