Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, Hibe 1R21AG031965-01A1 tarafından desteklenen oldu. MK Yaşlanma Ellison Tıp Vakfı Yeni Scholar.

Bölüm 1: yaşlanma kültürlerin Hazırlık <ol><li> YEPD agar plakları üzerine donmuş stokları (% 1 maya özü,% 2 bacto-pepton,% 2 agar,% 2 glukoz) faiz Streak suşları. </li><li> 30 ˚ C&#39;de 48 saat veya tek koloniler görünene kadar hücrelerin inkübe edin. </li><li> 5 ml (% 1 maya özü,% 2 bacto-pepton,% 2 glukoz) test tüplerinde YEPD sıvı ortamın içine tek koloniler ve inokülasyon seçin. </li><li> Grow 30 geceleme kültürleri ˚ C çalkalayıcı veya rulo davul kullanarak sürekli ajitasyon korurken. </li><li> 50 mcL gecelik kültür sentetik tam (SC) orta (Tablo 1) 5 ml inoküle edin. Genellikle üç SC kültürler incelendiğinde her bir suş için üç nüsha ömrü analiz biyolojik çoğaltma sağlamak için her bir suş için hazırlanmıştır. </li><li> 30 kültürlerin koruyun ˚ C (genellikle 2 veya daha fazla hafta) tüm deney için silindir tambur üzerinde sabit ajitasyon. </li></ol> Bölüm 2: bir canlılığı yaş noktası alarak SC medya kültürünün iki gün sonra, hücreler sabit faz olmalı ve ilk yaş noktası alınacak hazırdır. Daha sonraki yaş-iki hafta en az 2-3 gün her gün alınmalıdır. Her yaş noktası için: <ol><li> YEPD 145 mcL her kuyu doldurarak aşılama için Bioscreen 100-iyi Petek tabak hazırlayın. Sadece veri analizi için hiçbir hücre sonra YEPD ve en az bir sıra dolu bıraktığınızdan emin olun. </li><li> Inkübatör yaşlanma kültürler çıkarın. </li><li> Kısaca vorteks kültürünün herhangi bir dökmemeye dikkat ederek, Petek plaka inoküle ilk kültür. </li><li> Karışık kültür 5 mcL çıkarın ve Petek plaka ilk kuyuya pipetle. 5 mcL kısım çıkarmadan önce ve sonra her bir test tüpünde ağız Alev. </li><li> Her yaşlanma kültür her kültüre uygun iyi bir konuma dikkat emin olmak için bu yordamı tekrarlayın. Özdeş iyi pozisyonlar tüm deney boyunca nokta sonraki her yaş için kullanılmalıdır. </li><li> 30 ˚ C inkübatör içine kültürleri aşılar bittiğinde değiştirin. </li></ol> Bölüm 3: Bioscreen C MBR makine yükleme <ol><li> Inkübatör bölmesi kapağı kaldırarak teşhir etmek ve örnek tepsisi kapağı çıkarın. </li><li> Yeni inoküle Petek plaka örnek tepsi (tek bir plaka okuma, soldaki yuvanın) içine yerleştirin. </li><li> Örnek tepsi kapağını değiştirin ve inkübatör bölmesi kapağı düşük. </li><li> Isı transfer akışkanı minimum dolum seviyesi üzerinde olduğundan emin olmak için kontrol edin. Düşük, sağlanan ısı transferi sıvısı ile 1000 mcL pipet kullanarak daha fazla eklemek. </li><li> &quot;EZExperiment&quot; Bioscreen yazılım kullanarak, Saccharomyces cerevisiae için uygun büyüme eğrileri elde etmek için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: <ul><li> Numune sayısı: medya ya da 200 kuyu sayısını girin </li><li> Filtre: 420-580nm, Geniş Bant </li><li> Sıcaklık: 30 ˚ C </li><li> Deneme Uzunluğu: 1 Gün, 0 saat, 0 saniye </li><li> Ölçüm Aralığı: 30 dakika </li><li> Çalkalamalı, Sürekli sallayarak, Yüksek </li></ul></li><li> Okuma başlamak için &quot;Başlat&quot; düğmesini tıklayın. </li></ol> Bölüm 4: Veri Analizi Genellikle iki hafta boyunca, altı yaş noktaları alınır. Gün 2, 4, 6, 9, 11 ve 13 yaş noktaları alınır. Deneysel tasarım ve test edilen suşların bağlı olarak, yaş puan daha fazla veya daha az sıklıkla veya 2 haftadan daha uzun süre almak için istenebilir. Bu veri analizi çok daha kolay hale getirecek her yaşlanma kültür, her yaş noktada aynı iyi konumuna karşılık geldiği gibi, her yaş noktası için aynı sırayla Petek plaka yüklemek için önemlidir. <ol><li> Bioscreen C MBR makineden çıktı dosyalarını alın. &quot;EZExperiment&quot; yazılım, Microsoft Excel gibi diğer yazılımları ile uyumlu bir sekme ile sınırlandırılmış dosya olarak Bioscreen veri çıkışı. Ilk sütun gösterir OD ölçümü ne zaman Bioscreen Petek levhalar (Şekil 1) Her iyi temsil sonraki sütunlar, deney sırasında çekildi. </li><li> Her sütundaki ilk OD okuma silin. Bu okuma &quot;gürültü&quot;. </li><li> Her sütunun tüm OD değerleri yalnız YEPD iyi OD değeri çıkarılarak veri Normale. Bu medya tarafından arka plan absorbans kaldırır. </li><li> Akıbet eğrileri çizilir. Eğrileri, yaş bir fonksiyonu (Şekil 2) olarak kayacak. Örneğin, altı kez puan üzerinden sütun 1 (Petek plaka 1) akıbet eğrilerinin çizilmesi, zamanla eğrilerin ayrı bir sağa kayma var. </li><li> Her gün 2 yaş noktası büyüme kinetiği dayalı katlama süresi (δ) hesaplayın. Denklemin iki katına zaman hesaplamak için kullanılan as: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" alt="Denklem" /> OD 1 ve OD 2 ardışık OD ölçümleri ve t 1 ve t 2 ölçümler arasındaki zaman temsil nerede. 0,5 OD değerleri arasında 0.2 kat, sadece iki katına hesaplayın. Bu değerlerin ortalaması çok iyi iki katına zaman. 0,5 OD değerleri arasında 0.2 kat, sadece iki katına hesaplayın. Bu değerlerin ortalaması çok iyi iki katına zaman. Çoğu yabani tip maya suşları iki katına çıkma süresi 85 ila 90 dakika arasında bir değer vermek gerekir. </li><li> Her yaş noktası için, yaş başlangıç ​​noktası (2 gün) göre akıbet virajlarda zaman kaydırma (¨ t) hesaplar. Bunu yapmanın kolay bir yolu, yaş noktası ilk ve sonraki her yaş noktası arasındaki 0.3 OD ulaşmak için her bir kuyu için aldı süresini farkı belirlemek için. Ln karşılık gelen lineer regresyon denklemini (OD) belirli bir sıra 0.3 OD ulaştığı zaman, iki zaman noktaları braketi OD = 0.3 arasındaki zamanın bir fonksiyonu olarak hesaplanabilir. </li><li> Sağkalım eğrisi Şekil 3. üretmek için her yaş noktası hayatta kesir hesapla. % 100 canlılığı ilk yaş noktası (2 gün) tanımlayın. Birbirini izleyen her yaş noktası için denklem kullanılarak yüzde hayatta kalma hesaplayın: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" alt="İkinci Denklemi" width="245" height="115" /> s n hayatta kalma yüzdesi, ¨ t n zaman kaydırma ve δ n katlama süresi . </li><li> Yaş bir fonksiyonu olarak canlı hücrelerin fraksiyonu (veya yüzde) planlamakla sağkalım eğrileri (Şekil 3B) olarak her iyi (veya çoğaltmak kuyu) için istenen oluşturun. </li><li> Her bir kuyu için hayatta kalma ayrılmaz (SI) hesaplayın. SI hayatta kalma eğrisi altında kalan alan olarak tanımlanır ve formül ile tahmin edilebilir: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" alt="Denklem 3" width="400" height="79" /> nerede yaş n yaş noktası (örneğin 2, 4, 6, 9, 11, ve 13) ve s n bu yaş noktada hayatta kalma değerdir . </li><li> SI ve sağkalım verileri çoğaltmak kuyuların istatistiksel parametreler belirleyin. Ortak ilgi istatistiksel parametreleri ortalama, medyan, ve her set biyolojik çoğaltır için varyans içerir. Bir t-testi ya da benzeri analiz SI farklı deney ve kontrol grupları için ikili karşılaştırma için kullanılabilir. Aynı zamanda biyolojik çoğaltır ortalama 4,8 olarak açıklanan sağkalım eğrileri oluşturmak için istenebilir. </li></ol> Bölüm 5: Temsilci sonuçları Deney bitiminde, birkaç farklı suşları veya koşullar için kronolojik yaşlanma potansiyelini belirlemek için yeterli sağkalım eğrisi ve yapılan veri analizi çizilen olacaktır. Eğer düzgün bir şekilde gerçekleştirilir, Bioscreen C MBR makine elde edilen büyüme eğrileri Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi benzer görünmelidir ve sağkalım eğrileri Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi olmalıdır. Genel olarak, burada açıklanan koşullar altında kültür yabani tip hücrelerin 7 gün sipariş üzerine medyan kronolojik ömrü olacak. Farklı suşları ve% 0.05 glukoz medya büyüme gibi bazı koşullar altında hayatta kalma arasında önemli farklılıklar görülmektedir, medyan sağkalım 30 gün aşabilir. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" alt="" /> Bioscreen programı &quot;EZExperiment&quot; Şekil 1. Veri çıkışı. Sütun absorbans okuma alındığı zaman görüntüler. Ardışık sütunlar yaşlanma kültürleri alınan hücreleri ile inoküle Petek plaka kuyulardan temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" alt="" /> Şekil 2 bir deney boyunca tek bir biyolojik çoğaltıldıktan sonucudur eğrileri. Yaşlanma kültür hücreleri canlılığını kaybettiği zamanla eğrileri belirgin bir değişim vardır. Başlangıç ​​noktası (2 gün) ve ardışık bir zaman noktası arasındaki zaman uzunluğu, o belirli bir yaşta canlılığı belirler. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" alt="" /> Şekil 3. A) Şekil 1 akıbet verileri kullanılarak oluşturulan bir sağkalım eğrisi. Gün 2 zaman noktası% 100 canlılığı noktası olarak ayarlanır. B) iki suşunun Nihai sağkalım eğrileri aynı deneyi test. Bu sağkalım eğrileri, biyolojik ve her bir suş için çoğaltır üç ortalama canlılığı temsil eder. Hata çubukları biyolojik çoğaltır içinde standart sapmasını temsil eder. Sağkalım eğrisi altında gölgeli alanda 1 suşu için hayatta kalma ayrılmaz (SI) temsil eder. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tablo 1. Kronolojik Yaşlanma Araştırmaları kullanılır Sentetik Tanımlı Orta (suşu background BY4743) </td></tr><tr><td> Bileşen </td><td> Konsantrasyon (g / L) </td></tr><tr><td> D-glukoz </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Maya azot taban (-AA/AS) </td><td> 1,7 </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 5,0 </td></tr><tr><td> Adenin </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-Arginin </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Aspartik asit </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> L-Glutamik asit </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> L-Histidin </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> L-Leucine </td><td> 0,3 </td></tr><tr><td> L-Lizin </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> L-Methionine </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Fenilalanin </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-Serine </td><td> 0,375 </td></tr><tr><td> L-Threonine </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> L-Triptofan </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-Tyrosine </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> L-Valin </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> Urasil </td><td> 0,1 </td></tr></tbody></table> Not: Bu tarif diploid BY4743 suşu auxotrophies için hesaplar. Amino asit auxotrophies sentetik tam orta 5X bir final konsantrasyon ekleyerek telafi edilmelidir.

<ol>
	<li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+aging+in+yeast:+the+means+to+the+end.">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29 (2008).</li><li>Kaeberlein, M., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of models for human aging. , 109 (2006).</li><li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73 (2003).</li><li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span.">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113 (2008).</li><li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast.">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733 (2006).</li><li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055 (2004).</li></ol>

Burada açıklanan yüksek verim kronolojik ömrü tahlil, yaşlanma, yüksek doğruluk ve hassasiyet ile suşlarının çok sayıda potansiyel ölçülmesi için etkili bir yöntemdir. Bu yöntemin birincil önceden koloni oluşturan birim (örneğin 3 görmek) sayarak hayatta kalma belirlenmesi için klasik yöntemleri üzerinde, yüksek çözünürlüklü büyüme eğrileri elde etmek için bu Bioscreen C MBR makine olarak bir çalkalayıcı / inkübatör / plaka okuma cihazı kullanımı Her yaş noktası...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Bacto Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>211677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>288620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>214530</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S.</td>
<td>Reagent</td>
<td>MidSci</td>
<td>J630-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amino Acids</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spectrum</td>
<td>AM185</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextrose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>D16-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioscreen C MBR machine</td>
<td>Tool</td>
<td>Growth Curves USA</td>
<td>5101370</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioscreen 100-well Honeycomb plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Growth Curves USA</td>
<td>9502550</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells

Maya<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Yaşlanma araştırma alanında önemli bir model organizma olarak kanıtlanmıştır<sup&gt; 1</sup&gt;. Replikatif ve kronolojik ömürleri maya yaşlanma incelemek için kullanılan iki kurulan paradigmalar. Replikatif yaşlanma tek bir maya anne hücre yaşlanması önce ürettiği kızı hücrelerinin sayısı olarak tanımlanır; kronolojik yaşlanma zaman hücrelerinin uzunluğu ile tanımlanır olmayan bir bölme, sükunet gibi hayatta.<sup&gt; 2</sup&gt;. Biz kronolojik ömrü kantitatif ölçümü için yüksek verimli bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, ajitasyon altında tanımlanan orta ve sabit sıcaklıkta hücrelerin yaşlanma içerir. Her yaş noktada, hücrelerin bir alt nüfusun yaşlanma kültürünün kaldırılır ve zengin besi inoküle. Bioscreen C MBR makine kullanan yaşlı hücreleri bu alt nüfus için yüksek çözünürlüklü bir büyüme eğrisi elde edilir. Canlı hücreler, her yaş noktada büyüme kinetiği dayalı, her bir alt-nüfus oranı belirlemek için bir algoritma uygulanır. Bu yöntem, tekrarlanabilirlik ve hassas korurken diğer kronolojik ömrü testleri karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az zaman ve kaynak gerektirir. Bu testte yüksek verimlilik doğa daha karmaşık organizmalar daha fazla test için yeni uzun ömürlü değiştiriciler tanımlamak için, büyük ölçekli, genetik ve kimyasal ekranlar için izin vermelidir.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells at JoVE.com

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Maya Kronolojik yaşlanma, sabit faz zaman ile ilişkili hücre canlılığı kaybı anlamına gelmektedir. Burada maya kronolojik ömrü kantitatif olarak belirlenmesi için yüksek verimli bir yöntem açıklanmaktadır.

Yaşlı Hücre akıbet tarafından Maya Kronolojik Ömrü miktarının

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

quantifying-yeast-chronological-life-span-by-outgrowth-of-aged-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K Görüntüleme.  University of Washington. Maya Kronolojik yaşlanma, sabit faz zaman ile ilişkili hücre canlılığı kaybı anlamına gelmektedir. Burada maya kronolojik ömrü kantitatif olarak belirlenmesi için yüksek verimli bir yöntem açıklanmaktadır.

Video: Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Canlı İmmobilize Maya Hücreleri Görselleştirme Hızlı Tekniği

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Biyoloji

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

İnsan çevresel kanından üretilmesi ve kültür Blood üremesi Endotel Hücreleri

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.