Finansman NIH hibe 5T32CA09216-26 (JSB için), ve K01 AR055619-01A1 ve 3 K01 AR055619-03S1 (DML için), yanı sıra Alex&#39;in Limonata Standı Vakfı tarafından, Harvard Kök Hücre Enstitüsü ve Amerikan Kanser tarafından sağlanan edilmiştir vardır Toplum.

1. Zebra balığı embriyoların DNA mikroenjeksiyon <ol><li> Rag2 Linearize: cMyc ve rag2: GFP 11 DNA yapıları 37 ° C gecede Noti her plazmid 10μg sindirerek. </li><li> Fenol: kloroform ekstresi ve plazmid çökelek ve 20μL H 2 O. her tekrar süspansiyon </li><li> DNA konsantrasyonu yüksek oranda DNA merdiveni 20μL, 10μL ve 5μL% 1 agaroz jel üzerinde her sindirilir plazmid 1:1, 1:5 ve 1:10 seyreltme çalıştıran belirleyin. Nicelikleme Bu tür genelde bir spektrometre okuma daha doğru. </li><li> DNA CG1-gerinim (ya da diğer singeneik suşu) içine enjeksiyon için 1M KCl 0,5 X TE 60ng/μL bir final konsantrasyon sulandırınız zebrafish embriyoları kullanarak 30ng/μL rag2: cMyc + 30ng/μL rag2: GFP. </li><li> Enjeksiyonlar önceden gösterilmiştir 12, 13 olarak yapılmalıdır. Kısacası, erkek ve kadın zebrafish çiftleşme odalarında bir gece önce enjeksiyon ayarlanır. Enjeksiyon gününde, DNA enjeksiyon iğnesi yüklenir, basınç 50μm çaplı bir kabarcık bir sahne mikrometre ile ölçülür, (30pg DNA) sınırdışı şekilde ayarlanır. Daha sonra, embriyolar DNA hücre içine yumurta sarısı içine enjekte ve tek hücreli aşamada enjekte edilir. Survival enjekte CG1 embriyoları ve larvaları, genellikle kötü ve sadece% 5 balık transgen başarıyla bir araya getirecek, bu yüzden&gt; 600 embriyolar bazı balık lösemi gelişecektir sağlamak için enjekte edilmelidir. </li><li> 28.5 ° C&#39;de enjekte edilen embriyolar Mağaza ve 24 saat sonra ölü embriyolar kaldırmak. Hayvanlar daha sonra 5 gün yaşam büyük tanklara aktarılır ve daha önce 14 açıklandığı gibi kaldırdı. </li></ol> 2. Birincil T-ALL Zebra balığı larvaları için tarama <ol><li> Enjeksiyon sonrası yaklaşık 28 gün, bir petri balık sistem su 25ml 4NG / m Tricane-S 200μL ekleyerek larva zebrafish uyutmak. </li><li> T-ALL 485/20 bir dalgaboyu ve 530/25 emisyon GFP floresans (Şekil 1) tespit etmek için filtre kullanarak, 20X büyütme Epifloresans bir mikroskop kullanılarak floresan-etiketli larva gelişimi için inceleyin. </li><li> Negatif olanlar ayrı tümör pozitif larvaları. Negatif larvaları daha sonraki bir zaman noktasında muayene olabilir, bir kez tümörleri herhangi bir T-ALL olumlu balık cevapsız emin olmak için, daha büyük artış var olabilir. </li><li> Monitör T-ALL Epifloresans mikroskop kullanılarak tümör büyümesini izlemek için her hafta en az bir kez olumlu bir balık. </li></ol> 3. İzolasyon ve saflaştırma floresan etiketli birincil lösemi hücrelerinin <ol><li> GFP pozitif lösemi hücrelerinin&gt;% 50 hayvanın elinden almış, 9ml balık sistemi su içeren bir petri 4ng/mL Tricane-S 1ml ekleyerek balık kurban. </li><li> Balık hücreleri tampon% 5 fetal sığır serumu ile 1mL 0.9X PBS içeren yeni bir petri kabına yerleştirin. Bir jilet, pipetlemeyin büyük hücre kümeleri ayırmak karışımı ile balık ıslatarak yumuşatmak, sonra 50ml tüp içine 40μm mesh süzgeç vasıtasıyla hücrelere geçerler. Bu tek hücre içine bütün doku kümeleri ayırmak gerekli değildir. </li><li> 4ml polistiren tüp hücrelerinin pipetleyin 500μL. Ölü hücreleri etiket 1μL 1mg/ml propidium iyodür (PI), ekleyin. Vortex, daha sonra buz üzerinde hücreler tutun. </li><li> , Vahşi bir CG1 balık türü Kurban ıslatarak yumuşatmak ve toplam 50ml tüp 0.9X PBS transplant.Add 4ml% 5 FBS sırasında, tümör hücreleri için bir taşıyıcı olarak hizmet normal hücreleri toplamak için, yukarıdaki gibi aynı şekilde zorlanma 5 ml&#39;lik bir hacim. </li><li> 96 plaka pipetlemeyin 100μL/well sonra, 0.9X PBS içinde% 5 FBS normal hücreleri, sulandırmak için 3x10 5 hücre / mL sayın. </li><li> Aşağıdaki dozlarda kan hücreleri içeren 96 plaka bir Floresan Aktive Hücre Sıralayıcısı (FACS), tür, GFP pozitif, PI negatif tümör hücreleri (Şekil 2A, B): 10 hücre / 48 kuyu, 100 hücre / kuyu içine 24 kuyu, 1000 hücre içine / 12 kuyu, ve 10.000 hücre içine / 6 kuyu içine. Ayrıca, 10.000 hücreleri normal kan hücrelerinin olmadan bir kuyunun içine sıralanmış ve tekrar analiz sıralanmış hücreleri saflık ve canlılığını değerlendirmek için (Şekil 2C) FACS kullanarak olmalıdır. </li></ol> 4. Yetişkin zebrafish seyreltme nakli sınırlandırılması <ol><li> Pelet 2000xg 96-iyi bir plaka 10 dakika santrifüj edilerek hücreleri. </li><li> Süpernatantı 95μL çıkarın ve kalan 5μL hücrelerin tekrar süspansiyon. </li><li> Bir yetişkin (&gt; 60 gün) singeneik zebrafish ventral tarafta tutun, ve 26g / 2 &quot;mikro şırınga kullanarak, periton boşluğuna hücre süspansiyonu enjekte. Zebra balığı nakli öncesi anestezi olmak zorunda değilsiniz. Tipik olarak, 45 balık, 10 lösemi hücreleri ile nakledilen, 20 ile 100 hücre nakledilen, 7, 1000 hücreleri ve 5 balık ile nakledilen 10.000 T-ALL hücreleri nakledilen. </li></ol> 5. Lösemi başlatan hücre frekans belirlemek için analiz <ol><li> Nakli yaklaşık 28 gün sonra, bir 485/20 dalgaboyu ve 530/25 emisyon GFP floresan tespit için filtre kullanarak bir epifluoresence mikroskop ile nakledilen balık inceleyin. Enjekte edilen balıkların toplam sayısı başına olumlu bir balık numarasını kaydedin. </li><li> Tekrar gözden geçirin 90 gün kadar her 14 günde bir balık ve pozitif balık sayısını kaydedin. Can çekişen bir tümör pozitif balık hale geldiğinde, Tricane-S aşırı doz hayvan kurban. </li><li> Şekil 3 boyutlu olarak gösterildiği gibi bir tabloya sonuçları, Giriş. Web tabanlı ELDA (Extreme sınırlandırılması Seyreltme Analizi) istatistiksel yazılım veri yükleme <a href="http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html">http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html</a> tümör pozitif ve negatif hayvanların frekansı kullanır 15, birincil T-ALL içinde kendini sürekli yenileyen lösemi hücrelerinin sıklığını belirlemek için her doz nakli. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Singeneik balık embriyolara DNA mikroenjeksiyon genellikle 24 saat boyunca hayatta kalan embriyoların &lt;% 60 ile enjekte edilen embriyoların bir hayatta kalma oranı düşük sonuçları. Ayrıca, enjekte singeneik balık yaşam genellikle larva gelişimi sırasında, genellikle kötü &lt;% 20, 28 gün boyunca hayatta. T-ALL gelişecektir transgenik balık oluşturmak için çok sayıda embriyo enjekte bu nedenle önemlidir. Bir örnek olarak, CG1 gerginlik embriyolar rag2 enjekte edildi: cMyc + rag2: GFP. Transgenlerin GFP ifade her hücre cMyc ifade, böylece gelişmekte olan embriyonun co-ayırınız. Larva T-ALL 28 gün sonra (Şekil 1), ilköğretim için tarandı. Önceki iş enjekte balık yaklaşık% 5 (Şekil 1), timus içinde T-hücrelerinin GFP pozitif olduğunu göstermiştir ve bu balıkların% 100, T-hücrelerinin dönüştürülmüş 11 olarak lösemi gelişecektir . Zebrafish küçük bir kısmı, 28. günde tespit etmek çok kolaydır, daha gelişmiş lösemi sahip olsa da, çoğu sadece bir GFP pozitif timus (Şekil 1) sahip olacak, böylece larva tüm olumlu sağlamak için yüksek büyütme altında tek tek incelenir olmalıdır balık seçilir. GFP pozitif T-ALL hücrelerinin&gt;% 50 hayvanın gün 45-70 arasında geçeceği tahmin ediliyor. Zebrafish verilen örnekte 65 gün yaşam kurban edildi ve lösemi hücreleri izole edildi ve FACS seyreltme nakli sınırlandırmak için sıralanır. Tek hücre propidium iyodür negatif ve GFP pozitif (Şekil 2) 96-plaka halinde sıralanır. Reanalysis canlılığı (ideal% 95) ve saflık değerlendirmek için 10.000 sıralanmış hücreleri üzerinde yapıldı (ideal&gt;% 92, Şekil 2). Nakledilen T-alls genellikle 28 gün önce ortaya çıkan, ancak bazı tümörler geliştirmek için 60 gün daha sürebilir. Bu örnekte bazı T-alls (Şekil 3C) periton boşluğu doldurmak için genişletilmiş olan, daha ilerledi iken, 28. günde, erken evre tümörler, enjeksiyon bölgesi (Şekil 3B) yakın GFP pozitif hücreler bir alan olarak görüldü . T-alls üç farklı ilköğretim seyreltme hücre nakli deneyleri sınırlayıcı elde edilen veriler Şekil 3 boyutlu olarak gösterilmiştir. Bu deneyler için, 220&#39;den fazla hayvan, birkaç saat içinde tek bir kişi tarafından kolayca yapılabilir hangi, nakledilen. ELDA yazılımı kullanarak Veri analizi, ortalama 1 135 T-ALL hücreleri yayılan lösemi hücreleri (Şekil 3E), kendini sürekli yenileyen, o gösterdi. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 Zebra balığı larvaları, bez ile tek hücreli aşamada enjekte:: cMyc + bez:-eGFP birincil lösemi büyüme için tarandı 28 gün sonrası enjeksiyon . Balık (*) T-hücrelerinin timus içinde GFP pozitif vardı; T-hücrelerinin zaman içinde dönüştürülmüş olarak bu balığın T-ALL gelişecektir. Bu aşama, 28 gün çok yaygın. Bir balık (**) gelişmiş bir T-ALL yumuşak doku içine yayıldı. Kalan iki balık tümör büyüme için olumsuz. 16x büyütme görüntü alındı. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 floresan etiketli T-ALL hücreler hastalıklı hayvanların sıralanır ve sınırlayıcı seyreltme hücre nakli tayininde kullanıldı. Birincisi, bir kapı, tek hücreleri (sol üst panel) seçmek için çizilmiş oldu, sonra propidium iyodür negatif hücreler (orta sol panel) seçilir. Son olarak, bir kapı sadece GFP pozitif sıralama için lösemi hücrelerinin (sol alt panel) seçmek için çizilmiş oldu. Sıralama hücre nakli öncesi canlılığı ve saflık (sağ paneller) değerlendirmek için tekrar analiz edilmelidir. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 Zebra balığı nakli 28 gün sonra lösemi büyüme yönünden incelendi. Fish ya tümör negatiffonlanır (A), (B) enjeksiyon yerinde büyüyen küçük bir tümör, ya da ilerlemiştir lösemi (C). 7X büyütme görüntüleri alınmıştır. Her seyreltme nakledilen balık toplam sayısı başına lösemi pozitif balık toplam sayısı (D) olarak kaydedilir. Veri sayısını hesaplamak için web tabanlı ELDA programına girdi, kendini sürekli yenileyen, lösemi hücrelerinin ve alt ve üst% 95 güven aralığı (E).

<ol>
	<li>Zhou, B. -. B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-initiating+cells:+challenges+and+opportunities+for+anticancer+drug+discovery.">Tumour-initiating cells: challenges and opportunities for anticancer drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 8, 806-823 (2009).</li><li>Dick, J. E., Bhatia, M., Gan, O., Kapp, U., Wang, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+human+stem+cells+by+repopulation+of+NOD/SCID+mice.">Assay of human stem cells by repopulation of NOD/SCID mice.</a> Stem Cells. 15, 199-207 (1997).</li><li>Bonnefoixa, T., Bonnefoixa, P., Verdiela, P., Sotto, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+limiting+dilution+experiments+with+generalized+linear+models+results+in+a+test+of+the+single-hit+Poisson+assumption.">Fitting limiting dilution experiments with generalized linear models results in a test of the single-hit Poisson assumption.</a> J Immunol Methods. 194, 113-119 (1996).</li><li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+of+the+day:+zebrafish+as+a+human+cancer+model.">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li><li>Taylor, A. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Tumor+Assays:+The+State+of+Transplantation.">Zebrafish Tumor Assays: The State of Transplantation.</a> Zebrafish. 6, 339-346 (2009).</li><li>Mizgirev, I., Revskoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+clonal+zebrafish+lines+and+transplantable+hepatic+tumors.">Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors.</a> Nat Protocols. 5, 383-394 (2010).</li><li>Mizgirev, I. V., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantable+Tumor+Lines+Generated+in+Clonal+Zebrafish.">Transplantable Tumor Lines Generated in Clonal Zebrafish.</a> Cancer Research. 66, 3120-3125 (2006).</li><li>Smith, A. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115, 3296-3303 (2010).</li><li>Kelly, P. N., Dakic, A., Adams, J. M., Nutt, S. L., Strasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Growth+Need+Not+Be+Driven+by+Rare+Cancer+Stem+Cells.">Tumor Growth Need Not Be Driven by Rare Cancer Stem Cells.</a> Science. 317, 337-337 (2007).</li><li>Rosen, J. M., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Increasing+Complexity+of+the+Cancer+Stem+Cell+Paradigm.">The Increasing Complexity of the Cancer Stem Cell Paradigm.</a> Science. 324, 1670-1673 (2009).</li><li>Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tracking+of+T+cell+development,+ablation,+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish.">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7369-7374 (2004).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELDA:+Extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays.">ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> Journal of Immunological Methods. 347, 70-78 (2009).</li><li>Ignatius, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+identifies+that+myf5++embryonal+rhabdomyosarcoma-propagating+cells+are+dynamically+reorganized+during+tumor+growth.">In vivo imaging identifies that myf5+ embryonal rhabdomyosarcoma-propagating cells are dynamically reorganized during tumor growth.</a> , (2010).</li><li>Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27, 4242-4248 (2008).</li></ol>

Kanser araştırma zebrafish kullanarak büyük bir gücü nispeten düşük maliyetle çok sayıda hayvan kullanılabilir olması. Bu nakledilen toplam sayısı tümörler gelişir nakledilen hayvanların oranlarda tümör başlatan hücre frekansı belirlemek için kullanılan seyreltme hücre nakli deneyleri, sınırlayıcı özellikle önemlidir. Burada sunulan yöntem, 70&#39;in üzerinde transplant hayvanlar yayılan tümör hücre sayısının doğru bir tahmin, analiz başına kullanılır. Faydalı nakli dozlarda kullanılan hayvanların sayısı ve tümör hücreleri nakledilen dozu her ikisi de belli bir kanser model için optimize edilmiş olmalıdır, örneğin, ilk deneylerde, tümör başlatılması hücreler nadirdir gösterirseniz, 100.000, 50.000, 10.000 ve kişi başına 1.000 hücreleri olabilir nakli. Singenik zebrafish suşları seyreltme analizi sınırlamada yararlı. Ancak, bu suşların henüz yaygın olarak tüm laboratuarlarda kullanılan ve bazı zebrafish kanser modelleri sadece allojenik balık mevcut değildir. Kendini sürekli yenileyen hücre frekans singenik zebrafish 8 kullanılmış olsaydı göre 10-100 kat daha yüksek olarak hesaplanmıştır olabilir, ancak sınırlandırılması seyreltme hücre transplantasyonu, bağışıklık ablasyon geçiren vahşi-tip suşlar yapılabilir . Bazı tümör hücreleri yabancı bir mikroçevresinin nakli hayatta olmaz gibi, hücrelerin daha yüksek dozlarda non-immün eşlemeli, ışınlanmış alıcıların içine nakli için kullanılması gerektiğini not etmek önemlidir. Ayrıca, alıcı hayvanın bağışıklık sistemi kurtarır 21 gün sonra birçok tümörde gerileme başlayacak, bu yüzden hayvanların her 7 gün nakli sonrası tümör büyüme için değerlendirilmelidir. Burada sunulan yöntemler herhangi bir zebrafish kanser modeli ile kullanım için uygundur ve şimdiye kadar belirlemek için kullanılır olmuştur tümör başlatılması T-hücreli akut lenfoblastik lösemi 8, ve solid tümör modeli, rabdomyosarkom 16 hücre frekansı . Bu tümörler floresan bir onkogen ve floresan işaretleyici hem de embriyo ko-enjeksiyon etiketli; DNA co-ayıran, onkogen ifade herhangi bir hücreyi, floresan proteini 17 ifade çünkü . Hayvan kurban etmek gerek kalmadan tümör büyümesini izleme kolaylaştırır ve FACS tümör hücreleri izole etmek için ileri düz bir yol sağlar çünkü floresan tavsiye edilir iken, kendi arıtma kolaylaştırmak için, tümör spesifik vericiler antikorlar ile tümör hücrelerinin etiket mümkün zebrafish da olsa antikor boyama optimizasyon gerekebilir. Son olarak, bir kez, tümör yayılan hücrelerinin sıklığı belirli bir tümör türü için tespit edilmiştir, bu testlerin kendi cep frekansını yöneten mekanizmaları tanımlamak için kullanmak mümkündür. Örneğin, seyreltme nakli ya da kendilerini uyuşturucu ile dozajlanarak olabilir nakledilen balık sınırlayan önce primer tümör hücrelerinin yolağı spesifik inhibitörleri ile tedavi edilebilir. Ayrıca, tümörler kendilerini genetiği sonucunda primer tümör gen-express böylece, tek hücreli bir sahne balık ilgi bir gen enjekte ederek manipüle olabilir. Bu deneylerde, kendini sürekli yenileyen hücre frekansı üzerinde herhangi bir etkisi sınırlayıcı seyreltme testleri görülecektir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th></tr><tr><td> Noti restriksiyon enzimi </td><td> New England Biolabs </td><td> R0189 </td></tr><tr><td> Fenol: Kloroform </td><td> EMD Biyokimyasallar </td><td> 6805-OP </td></tr><tr><td> 5M KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td></tr><tr><td> Yüksek Menzil DNA merdiveni </td><td> Fermentas </td><td> R0621 </td></tr><tr><td> Singenik zebrafish </td><td></td><td> Referanslar 6-8 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Gibco </td><td> 16000-036 </td></tr><tr><td> Propidium İyodür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4864 </td></tr><tr><td> 26g / 2 &quot;mikroenjektör </td><td> Hamilton </td><td> 80366 </td></tr><tr><td> 40μm örgü hücre süzgeç </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish

Kendini sürekli yenileyen kanser hücrelerinin tümör büyümesini teşvik etmek için sınırsız bir yeteneğe sahip bir tümör içinde tek hücre tipleri, ve böylece yayılan tümör hücreleri veya tümör başlatan hücreleri olarak bilinir. Bu, hastanın prognozu 1 büyük ölçüde geliştirerek, bu yıkımı için kendini sürekli yenileyen hücreleri hedef tümörün ilerlemesini engellemek ve nüks durdurmak olacağı düşünülmektedir. Sıklığını belirlemek için en yaygın yolu kendi kendini yenileyen bir tümör hücreleri içinde artan dozlarda alıcı hayvanlar tümör hücreleri nakledilen bir sınırlayıcı seyreltme hücre nakli testi tümörler gelişir hayvanların oranı sayısını hesaplamak kullanılır kendi kendini yenileyen hücreler içinde orijinal tümör örneği, 2, 3 . İdeal olarak, çok sayıda hayvan doğru yayılan tümör hücreleri, sıklığını belirlemek için her sınırlayıcı seyreltme deneyde kullanılacak. Ancak, büyük ölçekli deneyler fareler içeren pahalı ve en sınırlayıcı seyreltme testleri Deneme başına sadece 10-15 fareler kullanır. Zebra balığı, genetik manipülasyon ve büyük ölçekli deneyler yapılabilir hangi ekonomi kendi kolaylığı nedeniyle büyük bir kısmı, bir kanser model olarak önem kazanmıştır. Ayrıca, zebrafish modellenir kanser türleri kendi meslektaşı insan hastalığı 4 yakından taklit olduğu tespit edilmiştir. Alıcı hayvanların alt öldürücü ışınlama, 21 gün sonra bağışıklık sisteminin yenilenme başka bir balık tümör hücrelerinin nakli için mümkün olsa da genellikle tümör regresyonu 5 neden olur. Singeneik zebrafish son yaratılması tümör nakli çalışmaları büyük ölçüde 6-8 kolaylaştırmıştır . Bu hayvanlar sağlam alıcı balık, ve tümör büyüme içine genetik olarak aynı, nakledilen tümör hücreleri aşılamak olduğundan uzun süre üzerinden takip edilebilir. Singenik zebrafish, kendini sürekli yenileyen hücre frekansı 9, 10 hafife bir yabancı mikroçevresinin büyüme, uyum sağlamak zorunda değilsiniz, bu tümör hücrelerinin seyreltme nakli deneyleri sınırlandırmak için idealdir. Ayrıca, tek hücre nakli başarıyla kendini sürekli yenileyen hücre sıklığı daha doğru bir tahmin sağlamak için hizmet, her ikisi de, kolay ve ekonomik bir kerede transplante edilebilir singeneik zebrafish 8 ve birkaç yüz hayvanlar, kullanarak tamamlanmıştır . Burada singeneik zebrafish ilköğretim floresan etiketli T-hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) oluşturma ve kendini sürekli yenileyen hücre sıklığını belirlemek için bu tümörler erişkin balık seyreltme sınırlayıcı nakli için bir yöntem sunulmuştur. Lösemi bir örnek olarak verilmiştir iken, bu protokolü, zebrafish herhangi bir kanser modeli kullanılarak yayılan tümör hücreleri sıklığını belirlemek için uygundur.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish at JoVE.com

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Sınırlandırılması seyreltme hücre nakli deneyleri, tümör yayılan hücrelerinin sıklığını belirlemek için kullanılır. Bu protokol, floresan etiketli lösemi ve yetişkin zebrafish periton boşluğuna seyreltme sınırlayan bu lösemi hücreleri izole etmek ve nakli nasıl detayları gelişen singeneik Zebra balığı üretmek için bir yöntem açıklanır.

Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

quantifying-frequency-tumor-propagating-cells-using-limiting-dilution

Research

JoVE Journal

Biology

19.1K Görüntüleme.  Harvard Medical School. Sınırlandırılması seyreltme hücre nakli deneyleri, tümör yayılan hücrelerinin sıklığını belirlemek için kullanılır. Bu protokol, floresan etiketli lösemi ve yetişkin zebrafish periton boşluğuna seyreltme sınırlayan bu lösemi hücreleri izole etmek ve nakli nasıl detayları gelişen singeneik Zebra balığı üretmek için bir yöntem açıklanır.

Video: Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biyoloji

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell therapy may alleviate many of the symptoms associated with lung disease and induce alveolar repair in adults. Concurrent with the ongoing search for stem cells applicable for human treatment, precise delivery and homing (to the site of disease) must be reassured for successful therapy. Here, I report that stem cells can safely be instilled via the trachea opening a non-stop route to the lung. This method involves a skin incision, caudal insertion of a cannula into and along the tracheal lumen, and injection of a stem cell vehicle mixture into airways of the lung. A broad range of media solutions and stabilizers can be instilled via tracheotomy, resulting in the ability to deliver a wider range of cell types. With alveolar epithelium confining these cells to the lumen, lung expansion and negative pressure during inhalation may also assist in stem cell integration. Tracheal delivery of stem cells, with a quick uptake and the ability to handle a large range of treatments, could accelerate the development of cell-based therapies, opening new avenues for treatment of lung disease.

Significant breakthroughs in stem cell identification are continuously being made. To translate these discoveries, however, novel methods for cellular delivery must be devised. Here I report that the airways provide a safe route for stem cell transplantation to the lungs.

Trakeotomi: Akciğer Kök Hücre Nakli Bir Yöntem

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

Zebra balığı Lens Nakli ve Göz Mutants Analizi Uygulaması

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

İnsan CD40 aktive B hücreleri üretilmesi

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Doku Hedeflenen Embriyonik Chimeras: Zebra balığı Gastrula Hücre Nakli

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Yenileyici Yetişkin Zebra balığı Tail Fin içine Morpholinos in vivo olarak Elektroporasyon

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Transgenik Kemirgen Deneyi sayısallaştırabilmek Erkek Germ Hücre Mutant Frekans

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...