Yazarlar, bu çalışmalara maddi destek sağladığı için Alcon'a teşekkür ediyor.

1. İnsan kornea epitel hücre kültürü
<ol><li>Ölümsüzleştirilmiş HCEC19'u, Dulbecco'nun modifiye Kartal orta/besin karışımıF-12'nin (DMEM/F12) %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin içeren 20 mL'si % 5 CO2ile kollajen kaplı 75 cm 2 şişelerde büyütün. NOT: Titreme gerekli değildir.</li>
	<li>Ortamı her 2−3 günde bir değiştirin.</li>
</ol>2. Hücrelerin test için hazırlanması
<ol><li>Hücreler neredeyse birleştiğinde kültür medyasını kaldırın.</li>
	<li>Her 75 cm2 şişeye 4−6 mL hücre ilişkilendirme çözeltisi ekleyin. Hücreler ayrılana kadar (yaklaşık 20−30 dk) hücreleri 37 °C'de kuluçkaya yatırarak mikroskop altında periyodik olarak kontrol edin.</li>
	<li>Her 75 cm 2 şişeye %10 FBS içeren 2−6 mL DMEM/F12 ekleyin.</li>
	<li>Şişenin içeriğini 50 mL santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 450−500 x g'da santrifüj edin. Üstnatantı borulayın ve önceden ısıtılmış ortamlardaki hücreleri yeniden biriktirin.</li>
	<li>Hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Toplam 1 x 105 hücre içeren ortam hacmini hesaplayın.</li>
	<li>48 kuyu kolajen-1 kaplamalı kültür plakasının her kuyusuna 1 x 105 hücre ekleyin. Kuyuya yeterli medya ekleyin, böylece kuyudaki son medya hacmi% 10 FBS ile 0,5 mL kültür DMEM / F12 olur. NOT: Yapay gözyaşı formülasyonu, HCEC'nin metabolik aktivitesinde bir azalma ile ölçülebilen sitotoksikliğe neden olabilir. Verilerin tutarlılığı, tohumlama yaparken her kuyuya aynı sayıda HCEC eklenmesine bağlıdır. 48 kuyu plakası için önerilen kültür konsantrasyonu 1 x 105. Memeli hücreleri resüsüre edildikten sonra santrifüj tüpüne yerleşebildiğinden, hücre süspansiyonunun HCEC'ye eşit şekilde dağıtılması için plakaları hücrelerle tohumlarken sık sık ajitasyonla hücrelerin yeniden kullanılması önerilir.</li>
	<li>Hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 24 saat kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>3. Hiçbir tahliye protokolü
<ol><li>Kontrol prosedürü<ol>
<li>24 saat inkübasyondan sonra kültür medyasını plakadan çıkarın.</li>
		<li>Hemen 150 μL test formülasyonu ve ortam kontrol çözümü ile tedavi edin.</li>
		<li>Hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Test çözümlerini hücrelerden kaldırın.</li>
		<li>Metabolik aktiviteyi test etmek için 0.5 mL% 10 metabolik boya çözeltisi ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 4 saat daha kuluçkaya yatır ve %5 CO2.</li>
		<li>4 saat kuluçka süresinden sonra, her kuyudan 100 μL metabolik boya çözeltisini çıkarın ve her 100 μL'yi 96 kuyu plakasının kuyusuna yerleştirin.</li>
		<li>Floresan plaka okuyucu (Malzeme Tablosu) kullanarak herkuyunun floresanını ölçün. Heyecan dalga boyunu 540 nm ve emisyon dalga boyunu 590 nm olarak ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ayırma protokolü yok (kurtarma prosedürü)<ol>
<li>3.1.1−3.1.4 adımlarını yineleyin.</li>
		<li>Her kuyuya 0,5 mL DMEM/F12 ortam ekleyin.</li>
		<li>37 °C'de 18 saat ve %5 CO2için bir kültür setini kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Ortamı çıkarın ve% 10 metabolik boya çözeltisinin 0,5 mL'sini ekleyin. 3.1.6 ve 3.1.7 adımlarını yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Tahliye protokolü
<ol><li>Kontrol prosedürü<ol>
<li>24 saat inkübasyondan sonra (adım 2.8), kültür medyasını plakadan çıkarın.</li>
		<li>Hemen 150 μL test formülasyonu ve ortam kontrol çözümü ile tedavi edin.</li>
		<li>Hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Test çözümlerini hücrelerden kaldırın.</li>
		<li>Hücreleri, hücrelerin içini çıkarmak için 5 dakika boyunca 37 °C ve% 45 RH odasına yerleştirin.</li>
		<li>Metabolik aktiviteyi test etmek için 0.5 mL% 10 metabolik boya çözeltisi ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 4 saat daha kuluçkaya yatır ve %5 CO2.</li>
		<li>4 saat kuluçka süresinden sonra, her kuyudan 100 μL metabolik boya çözeltisini çıkarın ve her 100 μL'yi 96 kuyu plakasının kuyusuna yerleştirin.</li>
		<li>Floresan plaka okuyucu kullanarak her kuyunun floresanını ölçün. Heyecan dalga boyunu 540 nm ve emisyon dalga boyunu 590 nm olarak ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kurtarma prosedürü<ol>
<li>4.1.1-4.1.5 adımlarını yineleyin.</li>
		<li>Her kuyuya 0,5 mL DMEM/F12 ortam ekleyin.</li>
		<li>37 °C'de 18 saat ve %5 CO2için bir kültür setini kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Ortamı çıkarın ve% 10 metabolik boya çözeltisinin 0,5 mL'sini ekleyin. 4.1.7 ve 4.1.8 adımlarını yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Veri analizi
<ol><li>Ortam denetiminin ortalama floresanını hesaplayın. Aşağıdaki formülü kullanarak örneğin yüzde canlılığını hesaplayın: Numunenin yüzde yaşayabilirliği = test numunesi floresan/ortam kontrolü floresan x 100 NOT: Ortam kontrol ortalaması %100 uygulanabilirliktir. Metabolik boya tek başına onunla ilişkili az miktarda floresan vardır. Metabolik boya reaktifinin floresanları, test örneklerinin medya kontrolüne % canlılığını hesaplamadan önce kontrol ve test numunesi floresanından çıkarılabilir.</li>
	<li>Denetim ve test örnekleri üzerinde eşit farklılıklar için bir normallik testi ve bir test gerçekleştirin.</li>
	<li>Normallik testi geçerse ve farklar eşitse, tek yönlü bir ANOVA gerçekleştirin. Belirli gruplar arasındaki önemli farkları belirlemek için geçici test sonrası çift yönlü karşılaştırmalar yapın (örneğin, Tukey veya Dunnett'in çoklu karşılaştırma testleri).</li>
	<li>Normallik testi geçerse ve farklılıklar farklıysa Welch'in ANOVA'sını gerçekleştirin. Belirli gruplar arasındaki önemli farkları belirlemek için geçici test sonrası çift yönlü karşılaştırmalar yapın (örneğin, Dunnett'in veya Games-Howell çoklu karşılaştırma testleri).</li>
	<li>Normallik testi başarısız olursa, nonparametrik bir test kullanın (yani Kruskal-Wallis testi). Belirli gruplar arasındaki önemli farkları belirlemek için geçici test sonrası çift yönlü karşılaştırmalar gerçekleştirin (yani Dunn'ın testi).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Maurer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+acute+corneal+injury+in+rabbits+with+surfactants+of+different+type+and+irritancy.">Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).</li><li>Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+viability+reagent+PrestoBlue+in+comparison+with+alamarBlue+and+MTT+to+assess+the+viability+of+human+corneal+epithelial+cells.">Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).</li><li>Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O'Brien, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+alamar+blue+reduction+for+the+in+vitro+assay+of+hepatocyte+toxicity.">Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity.</a> Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lubricating+agents+differ+in+their+protection+of+cultured+human+epithelial+cells+against+desiccation.">Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation.</a> Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).</li><li>Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+artificial+tears+against+desiccation+in+cultured+human+epithelial+cells.">Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells.</a> Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).</li><li>Ubels, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+investigation+of+the+efficacy+of+an+artificial+tear+solution+containing+hydroxypropyl-guar+as+a+gelling+agent.">Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent.</a> Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).</li><li>Hovakimyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+protective+effects+of+trehalose+on+desiccation+of+epithelial+cells+in+three+dimensional+reconstructed+human+corneal+epithelium.">Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium.</a> Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).</li><li>Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+efficacy+of+ocular+surface+lubricants+against+dehydration.">In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration.</a> Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).</li><li>Matsuo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+protects+corneal+epithelial+cells+from+death+by+drying.">Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying.</a> British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+activated+NLRP3+inflammasomes+initiate+inflammation+in+hyperosmolarity+stressed+human+corneal+epithelial+cells+and+environment-induced+dry+eye+patients.">Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients.</a> Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+Effects+of+L-Carnitine+Against+Oxidative+Injury+by+Hyperosmolarity+in+Human+Corneal+Epithelial+Cells.">Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).</li><li>Schulze, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trefoil+factor+family+peptide+3+(TFF3)+is+upregulated+under+experimental+conditions+similar+to+dry+eye+disease+and+supports+corneal+wound+healing+effects+in+vitro.">Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).</li><li>Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air+quality+and+relative+humidity+in+commercial+aircrafts:+An+experimental+investigation+on+short-haul+domestic+flights.">Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights.</a> Building and Environment. 67, 69-81 (2013).</li><li>van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+seasonality+and+effects+of+psychrometry+in+dry+eye+disease.">Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).</li><li>Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+culture+media+and+deswelling+agents+on+survival+of+human+corneal+endothelial+and+epithelial+cells+in+vitro.">Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).</li><li>Zachari, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Alamarblue+Assay+for+Adherent+Cell+Irradiation+Experiments.">Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments.</a> Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).</li><li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines.">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li><li>Benelli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systane+lubricant+eye+drops+in+the+management+of+ocular+dryness.">Systane lubricant eye drops in the management of ocular dryness.</a> Clinical Ophthalmology. 5, 783-790 (2011).</li><li>Davis, R. E., McGregor, G. R., Enfield, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity:+A+review+and+primer+on+atmospheric+moisture+and+human+health.">Humidity: A review and primer on atmospheric moisture and human health.</a> Environmental Research. 144 (Pt A), 106-116 (2016).</li><li>Calonge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Adverse+Environment+Chambers+in+Dry+Eye+Research.">Controlled Adverse Environment Chambers in Dry Eye Research.</a> Current Eye Research. 43 (4), 445-450 (2018).</li><li>McCulley, J. P., Uchiyama, E., Aronowicz, J. D., Butovich, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+evaporation+on+aqueous+tear+loss.">Impact of evaporation on aqueous tear loss.</a> Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 121-128 (2006).</li><li>Bron, A. J., Tiffany, J. M., Gouveia, S. M., Yokoi, N., Voon, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+aspects+of+the+tear+film+lipid+layer.">Functional aspects of the tear film lipid layer.</a> Experimental Eye Research. 78 (3), 347-360 (2004).</li><li>Purslow, C., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+surface+temperature:+a+review.">Ocular surface temperature: a review.</a> Eye &amp; Contact Lens. 31 (3), 117-123 (2005).</li><li>Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+of+the+MTT+assay:+Direct+and+off-target+effects+of+inhibitors+can+result+in+over/underestimation+of+cell+viability.">Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability.</a> Gene. 574 (2), 193-203 (2015).</li><li>Stockert, J. C., Horobin, R. W., Colombo, L. L., Blazquez-Castro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+salts+and+formazan+products+in+Cell+Biology:+Viability+assessment,+fluorescence+imaging,+and+labeling+perspectives.">Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives.</a> Acta Histochemica. 120 (3), 159-167 (2018).</li><li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology:+new+insights+into+their+cellular+reduction.">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li><li>Rampersad, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Applications+of+Alamar+Blue+as+an+Indicator+of+Metabolic+Function+and+Cellular+Health+in+Cell+Viability+Bioassays.">Multiple Applications of Alamar Blue as an Indicator of Metabolic Function and Cellular Health in Cell Viability Bioassays.</a> Sensors. 12 (9), 12347-12360 (2012).</li><li>Li, J., Zhang, D. L., Ward, K. M., Prendergast, G. C., Ayene, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyethyl+disulfide+as+an+efficient+metabolic+assay+for+cell+viability+in+vitro.">Hydroxyethyl disulfide as an efficient metabolic assay for cell viability in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 26 (4), 603-612 (2012).</li><li>Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+colorimetric+cell+proliferation+assays+in+immune+cells.">A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells.</a> Cytotechnology. 68 (4), 1489-1498 (2016).</li><li>Uzunoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+XTT+and+Alamar+blue+assays+in+the+assessment+of+the+viability+of+various+human+cancer+cell+lines+by+AT-101+(-/-+gossypol).">Comparison of XTT and Alamar blue assays in the assessment of the viability of various human cancer cell lines by AT-101 (-/- gossypol).</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 20 (8), 482-486 (2010).</li><li>McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+functions+in+cell+death+and+disease.">Caspase functions in cell death and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), a026716 (2015).</li><li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro.">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye &amp; Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li><li>Puhlev, I., Guo, N., Brown, D. R., Levine, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desiccation+tolerance+in+human+cells.">Desiccation tolerance in human cells.</a> Cryobiology. 42 (3), 207-217 (2001).</li><li>Garrigue, J. S., Amrane, M., Faure, M. O., Holopainen, J. M., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+Lipid-Based+Products+in+the+Management+of+Dry+Eye+Disease.">Relevance of Lipid-Based Products in the Management of Dry Eye Disease.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 33 (9), 647-661 (2017).</li><li>Lievens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+enhanced+viscosity+artificial+tear+for+moderate+to+severe+dry+eye+disease:+A+multicenter,+double-masked,+randomized+30-day+study.">Evaluation of an enhanced viscosity artificial tear for moderate to severe dry eye disease: A multicenter, double-masked, randomized 30-day study.</a> Contact Lens &amp; Anterior Eye. 42 (4), 443-449 (2019).</li></ol>

Üç yazar (Rekha Rangarajan, Howard A. Ketelson, Lakshman Subbaraman) Alcon'un çalışanlarıdır. Alcon bu projenin tek finansman kaynağı ve sponsorudur. Lyndon W. Jones, son 3 yılda aşağıdaki şirketlerden araştırma desteği veya ders onur ödülü almıştır: Alcon, Allergan, Contamac, CooperVision, GL Chemtec, Inflamax Research, J&J Vision, Menicon, Nature's Way, Novartis, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass ve Visioneering. Lyndon Jones aynı zamanda Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis ve Ophtecs için bir danışman ve/veya danışma kurulunda görev yapmaktadır. Aşağıdaki yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur: Richard Do, David J. McCanna, Adeline Suko, Daryl Enstone, Jaya Dantam.

Bu protokol, yapay gözyaşı çözeltilerinin hücre tahliyesine karşı koruyucu etkilerini belirlemek için tasarlanmıştır. Başlangıçta, hücreler hücreleri kaplamak için kuru göz damlalarına maruz kalır. Daha sonra, hücreler kurutulur ve formülasyonların desiccation stresinin zararlı etkilerini azaltıp azaltamayacağı değerlendirmek için metabolik aktivite izlenir. Bu adımlar, kuru göz formülasyonlarının kornea epitel hücrelerinin genel canlılığı üzerindeki genel etkisini anlamak için kritik öneme sahiptir.
Kuru göz formülasyonlarının çoğu kültür kuyularından çıkarıldıktan sonra, hücrelerle temas halinde olan kalan moleküllerin kimyası hücre kurumasını etkileyecektir. Bazı ürünler hücre buharlaşmasını en aza indiren yağların mikro emülsiyonlarını içerir20. Durulamadan sonra sürtünme analizini değerlendiren bir çalışma, kuru göz formülasyonlarının gelişmiş oturma süresinin bir göstergesi olabilecek bazı kuru göz formülasyonları için düşük sürtünmenin bakımını göstermiştir21. Bu tahlilin sınırlamalarından biri, kurutma korumasının diğer göz damlası formülasyonlarına göre değerlendirilebilmesine rağmen, değerlendirilen kısa kuruma süresi nedeniyle bu korumanın süresinin belirlenememesidir. Bu in vitro testte daha uzun kuruma süreleri, bir hücre monolayerinden genel olarak daha fazla nem içeriğine sahip çok katmanlı kültürlerin kullanılmasını gerektirebilir.
Sıcaklık ve nem değerleri değiştirilirse, hücrelerdeki formülasyonlar için özel kuluçka sürelerinin ve kuruma süresinin ayarlanması gerekebilir. Kuru göze katkıda bulunabilecek çevresel stres koşullarını simüle etmek için bir sıcaklık, RH ve hava akışı seçmek zor olabilir, çünkü mevsimsel ve yerel çevre koşulları oldukça değişkendir21. İnsan çalışmaları için modern ortam odaları sıcaklığı 5 °C ile 35 °C arasında, RH ise %5 ile %95 arasında değişebilir22. Bir evaporimetre ve sıkıca takılmış gözlükler kullanılarak, korneadan buharlaşma oranının %40−45 RH'de 0,037 μL/cm2/dkve RH'de %20−25 buharlaşma oranının 0,065 μL/cm2/dk 23olduğu belirlenmiştir. İn vitro model,15,çöl veya kuru iç mekan ortamları16gibi son derece düşük RH koşullarında formülasyonların koruyucu etkisine bakıyorsa, hücrelerden gelişmiş buharlaşma oranlarını karşılamak için kuluçka sürelerinin azaltılması gerekebilir. İnsan gözyaşı sıvısında, gözyaşlarını buharlaşmadan koruyan meibomian ve diğer bezlerden elde edilen çeşitli lipitler bulunur. Bu lipitlerin farklı erime noktaları vardır24. Sıcaklık değişimleri gözyaşı sıvısının akışkanlığını etkileyebilir, bu nedenle ortam sıcaklığında yapılan testler 37 °C'de yapılan testlerden önemli ölçüde farklı buharlaşma oranlarına sahip olabilir. Ortalama oküler yüzey sıcaklık aralığı 32,9 ila 36 °C25olduğundan, testin bu sıcaklık aralığına yakın yapılması önerilir.
Bu protokolde kullanılan metabolik boyaya (alamarBlue) ek olarak, ürün formülasyonlarının hücre metabolik aktivitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilecek başka kimyasal reaktifler de vardır. Tetrazolium tuzları (MTT, XTT, MTS, WST) kullanılabilecek alternatif kimyasallardır. Tetrazolium tuzlarındaki fark, MTT'nin pozitif yüklü bir molekül olmasıdır, böylece canlı hücrelerin sitoplazmını girebilir26. MTT, NAD(P)H27tarafından azaltılmasından sonra çözünmez hale gelir. Bir plaka okuyucusunda emici okumadan önce çözünmelidir. Diğer tetrazolium tuzları negatif yüklü28. Hücreye giremedikleri ve hücre içi moleküllerle doğrudan etkileşime giremedikleri için canlı hücre dışındaki ikincil moleküller tarafından azaltılmalıdırlar29. XTT, MTS ve WST-1 tahlilleri için, bir elektron kavrama ajanının eklenmesi 1-metoksi fenazin metosülfat (PMS) tahlillerin performansını artırabilir30. Tetrazolium tuzları kullanan metabolik testlerin aksine, alamarBlue ek bir çözünür veya elektron kavrama ajanları gerektirmez. Ayrıca, XTT, MTS veya WST-1'in aksine, alamarBlue hücre zarlarına nüfuz eder ve doğrudan hücresel enzimler27,29ile azaltılabilir. AlamarBlue'nun tetrazolium tuzları ile doğrudan karşılaştırılması, alamarBlue'nun HCEC 3,27 ,31,32dahil olmak üzere çeşitli hücre hatlarının metabolik aktivitesini değerlendirmek için daha hassas olduğunugöstermiştir.
Diğer biyokimyasal uç noktalar da insan kornea epitel hücrelerinin deşilerek korunmasını değerlendirmek için düşünülebilir. Floresan boyalar hücre zarı geçirgenliğini ve hücre esteraz aktivitesini tespit etmek için kullanılabilir1. Ayrıca, apoptoz hücre yüzeyinde apoptotik belirteçler için boyama veya kaspaz aktivitesi için ölçüm ile tespit edilebilir1,33. Diğer tahliller oftalmik ürünlerin HCEC sıkı kavşaklar üzerindeki etkilerini belirlemiştir34. Bu tahliller, bu makalede açıklanan tahliye prosedürlerinden yararlanarak gelecekteki değerlendirmelere dahil edilebilir.
Göz kurusunun birçok nedeni vardır. Göz kuruluğu, gözyaşı salgısının azalması, oküler yüzey iltihabının artması veya oküler yüzeyde artan dehidratasyondan kaynaklanabilir. Kurutma koşullarında hücrelerinin kurumasını önleyen kuru göz damlasının buharlaştırıcı kuru göz kullanımı olan bireyler için göz kuruluğu belirtileri hafifletilebilir. Bazı kuru göz formülasyonlarındaki sorunlardan biri de oküler yüzeye zarar verebilecek koruyucuların varlığıdır. Yaralı hücreler, kuru göz hastalarına yardımcı olmaz, çünkü yaralı hücreler kurutma stresine daha duyarlı olduğu için daha fazla hücrenin ölmesine neden olabilir35.
Garrigue ve ark.36 tarafından yapılan yeni bir inceleme makalesi, lipid bazlı ürünlerin buharlaştırıcı kuru gözü hafifletmek için nasıl hareket ettiğine dair mevcut bilginin bir değerlendirmesini sunmaktadır. Lipid eksikliği yırtıklarına lipit eklemek buharlaşmayı önleyebilir, böylece hücrelerin yok olmasını önleyebilir. Ek olarak, humektifler oküler yüzeyde suyu çeken ve tutan moleküllerdir37. Çözelti #1 gliserin ve çözelti #3 propilen glikol humektiflerdir. Çözelti #3, HCEC'nin formülasyon bileşenlerinin lipit ve hümektatif özelliklerinden kaynaklanmış olabilecek daha koruyucu bir etki gösterdi.
Bu protokol, kuru göz formülasyonlarına maruz kaldıktan sonra HCEC'nin metabolik aktivitesini değerlendirmek ve kurum stresini azaltmak için tasarlanmıştır. Bu makalede açıklanan yöntemler kullanılarak, buharlaştırıcı kuru gözden muzdarip insanlar için yeni nonirritating ve koruyucu göz damlaları geliştirilebilir.

Stabilite, pH, ozmolarite ve etkinliği korumak için çok doz oftalmik çözeltilerde birçok farklı bileşene ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, oküler çözeltilerdeki koruyucular veya yüzey aktif maddeler gibi bazı kimyasallar kornea epiteline zarar verebilir1,2. Oftalmik formülasyonlarda bu çeşitli bileşenlerin neden olduğu potansiyel hasarı değerlendirmek için insan kornea epitel hücreleri (HCEC) kullanılarak hücre canlılığı testleri yapılabilir. Hücre hasarını değerlendirmek için özellikle yararlı olan in vitro tahlillerden biri alamarBlue tahlil3. Bu testte, metabolik boya (yani alamarBlue), hücre canlılık göstergesi olarak işlev gören resazurin içerir. Hücresel solunum sırasında, resazurin elektronları kabul 4 kabullarakrezorufin'e düşürülür. Rezorufin azalması, floresan olmayan bir molekülden spektrofluorometre5kullanılarak tespit edilebilen floresan moleküle bir değişikliğe neden olur.
Bu araştırmada, kuru göz ürünlerinin bir in vitro modelde nasıl performans gösterebileceğini belirlemek için kornea epitel hücrelerinin iki farklı tedavisi gerçekleştirilir. İlk değerlendirmede, hücreler bu ürünlerle 30 dakika boyunca tedavi edilir. Tedaviden sonra, hücreler kuru göz ürünlerine maruz kaldıktan hemen sonra ve iyileşme zaman aralığından sonra metabolik aktivite açısından değerlendirilir. Bu değerlendirme, bu ürünlerin bir nem odasında kurutulmasından önce hücreler üzerindeki etkisini belirler. Bu çözeltilerdeki çözelti koruyucuları, yüzey aktif maddelerini veya tamponları metabolik boya kullanılarak tespit edilebilen hücreler üzerinde bazı sitotoksik etkilere sahip olabilir.
İkinci değerlendirme, kuru göz ürünlerine maruz kalma ve kuruma sonrası hücrelerin metabolik aktivitesini belirler. Bu değerlendirmede, ürün tedavisi hücrelere desiccation hasarına karşı koruma sağlarsa, hücrelerin metabolik aktivitesi korunacaktır. Kuru göz ürünü hücreleri lipitlerle kaplayabilirse veya ürün hücrelere nem ekleyerek çevredeki sıvıyı emebilirse, kurumuş meydana gelen zararlı etkilerden hücre koruması oluşabilir.
Bu protokol, hücreler üzerindeki ciddi çevresel stres koşullarını simüle etmek için tasarlanmıştır. Diğer çalışmalar bu dış stresi oluşturmak için çeşitli modeller kullanmıştır. Bazı çalışmalar laminar akış davlumbazlarındaki hücreleri kurutmuş6,7,8, diğerleri oda sıcaklığı ve çeşitli bağıl nem (RH) değerlerini 9 ,10,11kullanmıştır. Kuru göz koşullarını simüle etmenin bir yöntemi, inkübasyon çözeltisinin ozmolaritesini arttırmaktır12,13. Olumsuz çevresel koşulları simüle etmek için bir başka in vitro yöntem, kuru göz hastalarının gözyaşı sıvısını simüle etmek için hücre ortamına sitokin eklemektir14. Bu testler kimyasalların ozmotik stresi nasıl azalttığını veya bağışıklık sistemini nasıl uyardığını değerlendirebilen ilginç modeller olsa da, bu modeller kimyasal formülasyonların hücreleri desiccation stresinden nasıl koruyabileceğini doğrudan göstermez.
Tahliye modeli 37 °C ve%45 RH sıcaklık/nem odası kullanır. Oküler yüzeyden buharlaşmaya neden olabilecek çevresel koşulları simüle eder. 15 uçak kabinlerinde veya16 kış aylarında kapalı ortamlarda bulunan düşük nem gibi diğer aşırı çevresel koşulların simülasyonları da bu yöntem kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Hücre kültürü modellemesi, desiccation stresinin insan korneası üzerindeki etkisini simüle etmek için kullanılır. Hücre stresini tespit etmek için hücre sağlığı üzerindeki etkiyi belirlemek için hücre canlılığı testi yapılır. Strese olup olmadıklarını belirlemek için hücreler üzerinde birkaç farklı fizyolojik test yapılabilir17. Bu test prosedüründe yapılan analizde piyasada bulunan metabolik boya ( Malzeme Tablosu ) sunusunulmuştur. Toksik olmadığı, büyüme ortamlarında çözünür olduğu ve hücre fiksasyonu olmayan hücreleri değerlendirebileceği için diğer birçok hücre stres testinde avantaja sahiptir18. Bu prosedürde hücreler her tedaviden hemen sonra metabolik aktivite için test edilir ve ikinci bir hücre kümesi büyüme ortamına geri yerleştirilir ve 18 h iyileşmeden sonra değerlendirilir. Bir iyileşme döneminden hemen sonra ve sonra test etmenin nedeni, metabolik aktivite üzerinde acil etkilere neden olan hücre hasarını ve gecikmiş etkilere neden olan hücre hasarını tanımlamaktır. Ayrıca, bu formülasyonların kısa vadeli ve uzun vadeli hasar üzerindeki etkisini ve formülasyonların ilk hakaretten kurtulma /kurtarmama yeteneğini değerlendirme fırsatı sağlar.
Bu araştırma, çeşitli lipid içeren kuru göz ürünlerini HCEC metabolik aktivitesi üzerindeki etkileri için ve kurutma olmadan karşılaştırmak için kullanılır. Test edilen kuru göz ürünlerindeki bileşenler Malzeme Tablosundaaçıklanmıştır. Çözelti #1 bileşenler karboksimetilselüloz sodyum (%0,5), gliserin (%1) ve polisorbat 80 (%0,5), çözelti #2 hafif mineral yağdır (%1,0) ve mineral yağ (%4,5) ve çözelti #3 lipid mineral yağ ve propilen glikol demulcent' tir. Bu lipitler, HCEC'nin tahliyeye karşı korunmasını sağlaması beklenen formülasyon bileşenleridir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand collagen coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand collagen coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>There is No Phenol Red in this media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169&#8211;72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity/Temperature Chamber</td>
			<td>Associated Environmental Systems</td>
			<td>LH-1.5</td>
			<td>Economy Line Humidity Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100X concentration so add 1ml to each 99ml of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Optive Advanced (solution #1)</td>
			<td>Allergan, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soothe XP (solution #2)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td>Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Complete (solution #3)</td>
			<td>Alcon Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD&#174; (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12605036" target="_blank">12605036</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of artificial tear formulations on the metabolic activity of human corneal epithelial cells after exposure to desiccation

Yapay lipid içeren gözyaşı formülasyonları, eksik bir gözyaşı lipit tabakasının restorasyonu ile gözyaşı buharlaşmasını azaltmak için geliştirilmiştir. Hücrenin yok olmasını önleyen yapay gözyaşı formülasyonları, oküler yüzeyin korunmasına ve hücre metabolik aktivitesinin korunmasına neden olacaktır. Dehidratasyon sırasında, hücreler metabolik aktivite kaybı ve daha sonra hücre ölümü sürecinden geçer. Bu çalışma, yapay gözyaşı formülasyonlarının etkinliğini değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Metabolik boya (yani alamarBlue), düşük floresan molekül resazurin'den canlı hücrelerde floresan molekül rezorufin'e dönüşür. Yapay gözyaşı formülasyonunun biyolojik performansı, formülasyonun (a) hücre canlılığını koruma ve (b) desiccation'a karşı hücre koruması sağlama yeteneği olarak ölçülür. Büyüme ortamı ve salin hücre canlılığı/tahliye testleri için kontrol olarak kullanılır. Hücreler 30 dakika boyunca test çözümleriyle inkübe edilir ve daha sonra 37 °C'de 0 veya 5 dakika ve% 45 bağıl nemde kurur. İlk maruziyet ve hücre çıkışından sonra hücre metabolik aktivitesi daha sonra belirlenir. Sonuçlar, göz damlası formülasyonlarının hücre metabolik aktivitesi ve desiccation koruması üzerindeki karşılaştırmalı etkilerini göstermektedir. Bu yöntem, buharlaştırıcı kuru göz ile bireyleri tedavi etmek için tasarlanmış kuru göz formülasyonlarını test etmek için kullanılabilir.

Üç kuru göz formülasyonlarını karşılaştıran bir çalışmanın sonuçları Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu rakam, üç ürünün, çözüm #1, çözüm #2 ve çözüm #3(Malzeme Masası)HCEC'nin yaşayabilirliği üzerindeki etkisinde farklılıklar olduğunu göstermektedir. Çözüm #1 ve çözüm #2, HCEC'nin ayrılmadan önce metabolik aktivitesi üzerinde önemli bir etkiye sahipti. Bu, bu ürünlerde HCEC'nin metabolik aktivitesini bozabilecek formülasyon bileşenleri olduğu anlamına gelir. Çözelti #1 maruz kalan hücrelerin 18 saat iyileşmesinden sonra meydana gelen hücre metabolik aktiviteslerindeki ek düşüş, HCEC'nin başlangıçta yaralandığını ve 18 saat sonra yaralanmanın onarılmadığını göstermektedir. Buna karşılık, çözelti #3 HCEC'nin metabolik aktivitesi üzerinde sadece hafif bir etkisi vardı.
Şekil 2,lipit içeren bu kuru göz formülasyonlarının hücre koruması üzerindeki etkisini göstermektedir. 18 saat iyileşme aralığında %0'a yakın HCEC metabolik aktivitesi ile çözelti #1 ve çözelti #2 hücreleri desiccation stresinden korumadı. Ancak çözüm #3, desiccation stresine karşı biraz koruma sundu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig1.jpg"> Şekil 1: Göz kuruluğu lipid geliştirilmiş ürünlerin hücre canlılığı üzerine etkisi. Lipid içeren kuru göz ürünleri ile tedavi sonrası HCEC metabolik aktivitesi ile ölçülen bağıl canlılık. * = çözelti #3 göre istatistiksel anlamlılık (p < 0.05), uygun iyileşme dönemi için ortam kontrolüne göre Δ = istatistiksel anlamlılık (p < 0.05). Çubuğun yüksekliği ortalama değeri temsil eder ve hata çubukları <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60812/60812fig1large.jpg" target="_blank">SD'dir. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig2.jpg"> Şekil 2: Göz kuruluğu gelişmiş ürünlerin kurutma korumasına etkisi. Lipit içeren kuru göz formülasyonlarının hücre korumasına etkisi. Çözüm #1 ve çözüm #2 hücreleri desiccation stresinden korumadı ve zamanla desiccation etkilerinden kurtulamadılar. Buna karşılık, çözüm #3, desiccation stresine karşı biraz koruma sundu. * = p < çözelti #3 göre 0,05 ve uygun iyileşme süresi için tedavi edilmemiş (kontrol) ortama göre Δ = p < 0,05. Çubuğun yüksekliği ortalama değeri temsil eder ve hata çubukları <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60812/60812fig2large.jpg" target="_blank">SD'dir. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen burayı tıklatın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation at JoVE.com

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Bu protokolün amacı, farklı yapay gözyaşı formülasyonlarının bir in vitro model kullanarak insan kornea epitel hücrelerinin desiccation'dan korunup korunamayacağı değerlendirmedir. Yapay gözyaşı formülasyonlarına ve desiccation maruz kaldıktan sonra, insan kornea epitel hücreleri metabolik aktivite için değerlendirilir.

Yapay Gözyaşı Formülasyonlarının Desiccation'a Maruz Kalma sonrası İnsan Kornea Epitel Hücrelerinin Metabolik Aktivitesi Üzerine Etkisi

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

effect-artificial-tear-formulations-on-metabolic-activity-human

Research

JoVE Journal

Medicine

3.7K Görüntüleme.  Alcon Vision, LLC. Bu protokolün amacı, farklı yapay gözyaşı formülasyonlarının bir in vitro model kullanarak insan kornea epitel hücrelerinin desiccation'dan korunup korunamayacağı değerlendirmedir. Yapay gözyaşı formülasyonlarına ve desiccation maruz kaldıktan sonra, insan kornea epitel hücreleri metabolik aktivite için değerlendirilir.

Video: Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated respiratory epithelium. A protocol is described for isolating and exposing these cells to mainstream cigarette smoke (CS), in order to study epithelial cell responses to CS exposure. The protocol consists of three parts: the isolation of airway epithelial cells from mouse trachea, the culturing of these cells at air-liquid interface (ALI) as fully differentiated epithelial cells, and the delivery of calibrated mainstream CS to these cells in culture. The ALI culture system allows the culture of respiratory epithelia under conditions that more closely resemble their physiological setting than ordinary liquid culture systems. The study of molecular and lung cellular responses to CS exposure is a critical component of understanding the impact of environmental air pollution on human health. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the etiology of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and other tobacco-related diseases, which represent major global health problems.

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface as a model of differentiated respiratory epithelium. A protocol is described for isolating, culturing and exposing these cells to mainstream cigarette smoke, in order to study molecular responses to this environmental toxin.

Hava Sıvı Arabirimi Fare Solunum Epitel Hücreleri ve Deneysel sigara dumanına maruz kalma izolasyonu

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Tıp

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

Kemirgen Ürogenital Sinüs mezenşimin ve İnsan Kök Hücre Doku Rekombinasyon kullanarak İnsan Prostat epiteli oluşumu

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective mining of the information in the large-scale datasets that are obtained from gene expression microarrays, deep sequencing experiments or metabolic profiling is essential to uncover and then effectively target the critical regulators of diseased cell phenotypes. Estrogen Receptor &#945; (ER&#945;) is one of the master transcription factors regulating the gene programs that are important for estrogen responsive breast cancers. In order to understand to role of ER&#945; signaling in breast cancer metabolism we utilized transcriptomic, cistromic and metabolomic data from MCF-7 cells treated with estradiol. In this report we described generation of samples for RNA-Seq, ChIP-Seq and metabolomics experiments and the integrative computational analysis of the obtained data. This approach is useful in delineating novel molecular mechanisms and gene regulatory circuits that are regulated by a particular transcription factor which impacts metabolism of normal or diseased cells.

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

Meme Kanserinde Östrojen Reseptör Sinyali tarafından Metabolik Yönetmelik Sistem Biyolojisi

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or in buffer (washed platelets), by the use of one or a combination of agonists. The use of washed platelets separated from their plasma environment and in the absence of anticoagulants allows for studying intrinsic platelet properties. Among the large panel of agonists, arachidonic acid (AA), adenosine di-phosphate (ADP), thrombin and collagen are the most frequently used. The aggregation response is quantified by measuring the relative optical density (OD) over time of platelet suspension under continuous stirring. Platelets in homogeneous suspension limit the passage of light after the addition of an agonist, platelet shape change occurs producing a small transitory increase in OD. Following this initial activation step, platelet clots form gradually, allowing the passage of light through the suspension as a result of decreased OD. The aggregation process is ultimately expressed as a percentage, compared to the OD of platelet-poor plasma or buffer. Rigorous calibration is thus essential at the beginning of each experiment. As a general rule: calibration to 0% is set by measuring the OD of a non-stimulated platelet suspension while measuring the OD of the suspension medium containing no platelets represents a value of 100%. Platelet aggregation is generally visualized as a real-time aggregation curve. Turbidimetry is one of the most commonly used laboratory techniques for the investigation of platelet function and is considered as the historical gold standard and used for the development of new pharmaceutical agents aimed at inhibiting platelet aggregation. Here, we describe detailed protocols for 1) preparation of human washed platelets and 2) turbidimetric analysis of collagen-induced aggregation of human washed platelets pretreated with the food dye Brilliant Blue FCF that was recently identified as an inhibitor of Pannexin1 (Panx1) channels.

We describe a straightforward method for the isolation of washed platelets from human blood followed by agonist-induced platelet aggregation measurements by turbidimetry. As an example we apply this method for studying the aggregation response of human platelets to collagen after a pre-incubation with the Pannexin1 channel inhibitor Brilliant Blue FCF.

Kollajen ile indüklenen on Aggregation Pannexin1-inhibitör Parlak Mavi FCF: Türbidimetrik İnsanlar üzerinde Trombositler Yıkanmış

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be attributed to, in part, the dysregulation of autophagy. Aberrant changes in the expression of autophagy regulators in the placentas from obese pregnancies may be regulated by inflammatory processes associated with both obesity and pregnancy. Described here is a protocol for sampling of villous tissue and isolation of villous cytotrophoblasts from the term human placenta for primary cell culture. This is followed by a method for simulating the inflammatory milieu in the obese intrauterine environment by treating primary trophoblasts from lean pregnancies with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;), a proinflammatory cytokine that is elevated in obesity and in pregnancy. Through the implementation of the protocol described here, it is found that exposure to exogenous TNF&#945; regulates the expression of Rubicon, a negative regulator of autophagy, in trophoblasts from lean pregnancies with female fetuses. While a variety of biological factors in the obese intrauterine environment maintain the potential to modulate critical pathways in trophoblasts, this ex vivo system is especially useful for determining if expression patterns observed in vivo in human placentas with maternal obesity are a direct result of TNF&#945; signaling. Ultimately, this approach affords the opportunity to parse out the regulatory and molecular implications of inflammation associated with maternal obesity on autophagy and other critical cellular pathways in trophoblasts that have the potential to impact placental function.

Presented here is a protocol for sampling of human placental villous tissue followed by isolation of cytotrophoblasts for primary cell culture. Treatment of trophoblasts with TNF&#945; recapitulates inflammation in the obese intrauterine environment and facilitates the discovery of molecular targets regulated by inflammation in placentas with maternal obesity.

Plasenta Autophagy düzenlenmesi üzerinde anne obezite ile ilişkili iltihap etkisini incelemek için bir birincil insan Trofoblast modeli

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

Akut Chorioamnionitis'in Yenidoğan Bağırsak Gelişimi Üzerindeki Etkilerini İncelemek için Anne İltihaba Fetal MaruzIyetin Bir Murine Modeli

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its transparency. However, due to its external position, the cornea is highly susceptible to a wide variety of injuries that can lead to the loss of corneal transparency and eventual blindness. Efficient corneal wound healing in response to these injuries is pivotal for maintaining corneal homeostasis and preservation of corneal transparency and refractive capabilities. In events of compromised corneal wound healing, the cornea becomes vulnerable to infections, ulcerations, and scarring. Given the fundamental importance of corneal wound healing to the preservation of corneal transparency and vision, a better understanding of the normal corneal wound healing process is a prerequisite to understanding impaired corneal wound healing associated with infection and disease. Toward this goal, murine models of corneal wounding have proven useful in furthering our understanding of the corneal wound healing mechanisms operating under normal physiological conditions. Here, a protocol for creating a central corneal epithelial abrasion in mouse using a trephine and a blunt golf club spud is described. In this model, a 2 mm diameter circular trephine, centered over the cornea, is used to demarcate the wound area. The golf club spud is used with care to debride the epithelium and create a circular wound without damaging the corneal epithelial basement membrane. The resulting inflammatory response proceeds as a well-characterized cascade of cellular and molecular events that are critical for efficient wound healing. This simple corneal wound healing model is highly reproducible and well-published and is now being used to evaluate compromised corneal wound healing in the context of disease.

Here, a protocol for creating a central corneal epithelial abrasion wound in the mouse using a trephine and a blunt golf club spud is described. This corneal wound healing model is highly reproducible and is now being used to evaluate compromised corneal wound healing in the context of diseases.

Kornea Yara İyileşmesini İncelemek İçin Epitelyal Aşınma Modeli

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Sıçan DRG Sıkıştırma Modeli için Standartlaştırılmış Tuina Protokolü

Analgesic Effect of Tuina on Rat Models with Compression of the Dorsal Root Ganglion Pain

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar disc herniation, spinal canal stenosis, and intervertebral foramen stenosis. Although Tuina, a traditional Chinese manual therapy, has shown analgesic effects in clinical practice for the treatment of neuropathic pain, its underlying neurobiological mechanisms remain unclear. Animal models are essential for elucidating the basic principles of Tuina. In this study, we propose a standardized Tuina protocol for rats with compression of the dorsal root ganglion (DRG), which involves inducing DRG compression by inserting a stainless steel rod into the intervertebral foramen, performing Tuina manipulation with specific parameters of location, intensity, and frequency in a controlled environment, and assessing the behavioral and histopathological outcomes of Tuina treatment. This article also discusses the potential clinical implications and limitations of the study and suggests directions for future research on Tuina.

Yazar Spotlight: Tuina'nın Dorsal Kök Ganglion Ağrısının Sıkışması ile Sıçan Modelleri Üzerindeki Analjezik Etkisi  

This article presents a manipulation for treating chronic compression of the dorsal root ganglion in rats using Tuina therapy, along with a method for evaluating its effectiveness based on pain behavior and histopathological results.

Dorsal Kök Ganglion Ağrısının Sıkışması ile Tuina'nın Sıçan Modellerinde Analjezik Etkisi

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar ...