Bu protokol, oküler yüzey inflamasyonunun indüksiyonunda ve Meibomian bezi disfonksiyonunda rol oynayan ilişkili etkilenen organların toplanmasında rol oynayan adımları sırayla tanımlar. MGD'nin bu yeni modeli, hastalığın doğuştan gelen bağışıklık yönünün araştırılmasını, özellikle Meibomian bezini tıkayan nötrofil hücre dışı tuzakların oluşumunu sağlar. Protokolde sergilenen teknik, klinik öncesi bir aşamada topikal terapötik müdahaleleri tanıtmak için genişletilebilir.
Ayrıca, oküler eksüdaların ve organların toplanması tedavinin etkinliğini yansıtır. İmmünojen çözeltisinin intraperitoneal enjeksiyonunu gerçekleştirmek için, kafes ızgarasını kavrarken yedi ila dokuz haftalık C57 siyah altı anestezisiz dişi fareyi kuyruğundan yumuşak bir şekilde tutun. Daha sonra sırt derisini ve boyun bölgesini başparmak ve işaret parmağı arasında sıkıca tutun ve yüzük ile küçük parmak arasındaki kuyruğu ve alt uzuvları avuç içine sabitleyin.
Fareyi başı aşağı doğru sabit tutarak, hazırlanan immünojen çözeltisinin 100 mikrolitresini alt karın boşluğunun sağ veya sol çeyreğine enjekte edin. Bağışıklamadan sonra oküler yüzey zorluğu gerçekleştirmek için, anestezi uygulanan bir farenin gözüne beş mikrolitre ovalbümin veya ova veya salin uygulayın ve damlanın göz tarafından emilmesini sağlamak için beş dakika bekleyin. Daha sonra, meydan okumadan hemen sonra göze 50 mikrolitre steril salin uygulayarak oküler eksüdaları toplayın.
Oküler yüzey dokularının eksizyonu için, fareyi düz bir yüzeye yerleştirin ve% 70 etanol çubuğu ile göz çevresindeki orbital alanı dezenfekte edin. Göz çevresinde bir kesi oluşturmak için, kulak ile retroorbital sinüs arasında ve skuamöz kemiğin üzerindeki yüzey boyunca dikey olarak bir kesi yapın, insizyonu maksiller kemik boyunca alt göz kapağının altına yatay olarak ve frontal kemik boyunca üst göz kapağının üzerine uzatın. Kavisli forseps kullanarak disseke edilmiş dokuyu gözün etrafında dikkatlice tutun ve dokuyu ve göz küresini dışarı çekin.
Eksize edilen organları steril PBS'ye yerleştirin. Daha sonra stereo mikroskop altında bir neşter kullanarak, eksize edilen üst göz kapaklarının etrafındaki fazla yüz kası dokusunu kesin. Konjonktivayı toplamak için üst göz kapağını kuru bir Petri kabına yerleştirin.
Daha sonra ince cımbız ve bir neşter kullanarak beyazımsı mukus tabakasını göz kapağının iç yüzeyinden yavaşça soyun. Korneayı diseke etmenin yanında, göz küresini kuru buzun üzerine yeni bir kuru Petri kabına yerleştirin. Üç dakika sonra, çanağı tezgah yüzeyine sabit bir konumda yerleştirin.
Limbusun yanındaki kornea sınırında küçük bir kesi yapmak için ince, keskin makas kullanın. Kesiye göz küresinin etrafındaki neşterle devam edin, sklerayı korneadan ayırın. Daha sonra iris ve lens kalıntılarını korneanın arka tarafından tuzlu su çözeltisi ile cömertçe yıkayarak çıkarın.
Meibomian bezini ve deliklerini değerlendirmek için, eksize edilen göz kapaklarını stereo mikroskop altında dik konuma getirin. Ardından kamera pozlama süresine ve ISO ayarlarına göre, beyaz ışık epi-aydınlatması altında görüntüler yakalayın. Meibomian bezi bölgesini değerlendirmek için, eksize edilen göz kapaklarını yatay konuma yerleştirin ve kızılötesi kamera ile donatılmış stereo mikroskobun arka ışığını açın.
Pozlama süresini fotoğraf makinesi ISO'suna göre ayarlayarak görüntü yakalayın. Tuzlu su uygulanan fareler, gözleri tamamen açık olan sağlıklı oküler yüzeyler gösterdi. Buna karşılık, ova uygulaması ciddi oküler yüzey iltihabına, gözlerin dar açılmasına ve kemoz belirtilerine neden olur.
Eksize edilen göz kapakları, Meibomian bezinin deliklerini tıkayan büyük tıkanıklıklar ve ödem gösterdi, aksine göz kapağını kaplayan bezin küçük tıkaçlarını gösteren sağlıklı göz kapaklarının aksine. Bezin kızılötesi transilluminationunun daha fazla incelenmesi, Meibomian bezinin acini'sinin rasemik görünümünü ortaya koymaktadır. Salin meydan okuyan farelerin göz kapakları yuvarlak acini gösterdi.
Buna karşılık, ova uygulamaları alerjik göz hastalığı veya AEİ ile bazı bezlerin tahrip olmasına ve kaybına neden olmuştur. Göz kapaklarının histolojik analizi, sadece salin ile uygulanan farelere kıyasla genişlemiş Meibomian bezleri gösterdi. Göz küresinin kuru buz üzerinde inkübe edilmesi, limbusun yanındaki korneada insizyona ve korneanın skleradan ayrılmasına izin verdi.
Bu çalışma korneanın toplanmasını kolaylaştırmıştır. Ek olarak, ova uygulaması hiperemik bir görünüme sahip konjonktivaya ciddi inflamasyon uyguladı. Kemokin CXCL-1'in yüksek seviyeleri nötrofil ekstravazasyonunu, fagositozu ve degranülasyonu kolaylaştırır ve AED farelerinin süpernatantlarında akut faz yanıtına ve nötrofil infiltrasyonuna aracılık eden interlökin-6 gözlenmiştir.
Öte yandan, interlökin-10 konsantrasyonu hem naif hem de AED farelerde önemli bir değişiklik göstermedi. Bu yeni model, doğuştan gelen bağışıklık yollarını hedef alan ilaçların geliştirilmesini ve etkinliğinin değerlendirilmesini sağlar ve anti-enflamatuar ajanların uygulama şeklini veri madenciliğinde çok yardımcı olur. Organların uygun şekilde toplanmasından sonra, tek hücre dizilimi ve görüntüleme kitle sitometrisi gibi yüksek multipleks yöntemler bu protokolle uyumludur.
