Gli autori ringraziano Alcon per aver fornito sostegno finanziario a questi studi.

1. Coltura cellulare epiteliale corneale umana
<ol><li>Coltivare HCEC19 immortalato in contenitori da 75 cm2 rivestiti di collagene con 20 mL della miscela media/nutriente Eagle modificata di Dulbecco F-12 (DMEM/F12) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina a 37 °C con il 5% di CO2. NOTA: non è necessario scuotere.</li>
	<li>Cambia i media ogni 2−3 giorni.</li>
</ol>2. Preparazione delle cellule per la prova
<ol><li>Dopo che le celle sono quasi confluenti, rimuovere i supporti di coltura.</li>
	<li>Aggiungere 4−6 mL di soluzione di dissociazione cellulare a ogni flaconi da 75 cm2. Incubare le cellule a 37 °C fino a quando le cellule si staccano (circa 20−30 min), controllando periodicamente al microscopio.</li>
	<li>Aggiungere 2−6 mL di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS a ogni pallone da 75 cm2.</li>
	<li>Trasferire il contenuto del pallone in un tubo di centrifuga da 50 ml.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 450−500 x g per 5 min. Pipettare il supernatante e rimescolare le cellule in mezzi pre-riscaldati.</li>
	<li>Contare le cellule usando un emocitometro. Calcolare il volume di supporti che contiene un totale di 1 x 105 celle.</li>
	<li>Aggiungere 1 x 105 cellule a ciascun pozzo di una piastra di coltura rivestita con collagene-1 a 48 po '. Aggiungi abbastanza media al pozzo in modo che il volume finale dei media nel pozzo sia di 0,5 mL di cultura DMEM / F12 con FBS al 10%. NOTA: Una formulazione lacrimale artificiale può causare citotossicità che può essere misurata da una diminuzione dell'attività metabolica dell'HCEC. La coerenza dei dati dipende dall'aggiunta dello stesso numero di HCEC a ciascun pozzo durante il seeding. La concentrazione di coltura consigliata per 48 piastre di pozzo è 1 x 105. Poiché le cellule di mammifero possono depositarsi nel tubo di centrifuga dopo la sospensione, si consiglia di risosopendare frequentemente le cellule agitazione mentre seminano le piastre con le cellule in modo che la sospensione cellulare abbia l'HCEC equamente distribuito.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 °C e 5% CO2 per 24 ore.</li>
</ol>3. Nessun protocollo di essiccazione
<ol><li>Procedura di controllo<ol>
<li>Dopo l'incubazione di 24 ore rimuovere il supporto di coltura dalla piastra.</li>
		<li>Trattare immediatamente con 150 μL di una formulazione di prova e di una soluzione di controllo dei supporti.</li>
		<li>Incubare le cellule a 37 °C e 5% CO2 per 30 min.</li>
		<li>Rimuovere le soluzioni di test dalle celle.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 mL di soluzione di colorante metabolico al 10% per testare l'attività metabolica. Incubare le cellule per altre 4 ore a 37 °C e 5% CO2.</li>
		<li>Dopo il periodo di incubazione di 4 ore, rimuovere 100 μL di soluzione metabolica di colorante da ogni pozzo e posizionare ogni 100 μL in un pozzo di una piastra di 96 po porsi.</li>
		<li>Misurare la fluorescenza di ogni pozzo utilizzando un lettore di lastre fluorescenti(Tabella dei materiali). Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 540 nm e la lunghezza d'onda di emissione a 590 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nessun protocollo di essiccazione (procedura di ripristino)<ol>
<li>Ripetere i passaggi 3.1.1−3.1.4.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 mL di supporti DMEM/F12 a ciascun pozzo.</li>
		<li>Incubare un insieme di colture per 18 ore a 37 °C e 5% CO2.</li>
		<li>Rimuovere il supporto e aggiungere 0,5 mL di soluzione di colorante metabolico al 10%. Ripetere i passaggi 3.1.6 e 3.1.7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Protocollo di essiccazione
<ol><li>Procedura di controllo<ol>
<li>Dopo l'incubazione di 24 ore (fase 2.8), rimuovere il supporto di coltura dalla piastra.</li>
		<li>Trattare immediatamente con 150 μL di una formulazione di prova e di una soluzione di controllo dei supporti.</li>
		<li>Incubare le cellule a 37 °C e 5% CO2 per 30 min.</li>
		<li>Rimuovere le soluzioni di test dalle celle.</li>
		<li>Posizionare le cellule in una camera 37 °C e 45% RH per 5 minuti per essiccare le cellule.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 mL di soluzione di colorante metabolico al 10% per testare l'attività metabolica. Incubare le cellule per altre 4 ore a 37 °C e 5% CO2.</li>
		<li>Dopo il periodo di incubazione di 4 ore, rimuovere 100 μL di soluzione metabolica di colorante da ogni pozzo e posizionare ogni 100 μL in un pozzo di una piastra di 96 po porsi.</li>
		<li>Misurare la fluorescenza di ogni pozzo utilizzando un lettore di piastre fluorescenti. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 540 nm e la lunghezza d'onda di emissione a 590 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procedura di recupero<ol>
<li>Ripetere i passaggi 4.1.1-4.1.5.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 mL di supporti DMEM/F12 a ciascun pozzo.</li>
		<li>Incubare un insieme di colture per 18 ore a 37 °C e 5% CO2.</li>
		<li>Rimuovere il supporto e aggiungere 0,5 mL di soluzione di colorante metabolico al 10%. Ripetere i passaggi 4.1.7 e 4.1.8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Analisi dei dati
<ol><li>Calcolare la fluorescenza media del controllo multimediale. Calcolare la percentuale di vitalità del campione utilizzando la formula seguente: Percentuale di vitalità del campione = fluorescenza del campione di prova/fluorescenza di controllo del supporto x 100 NOTA: La media di controllo dei supporti è al 100% di vitalità. Il colorante metabolico da solo ha una piccola quantità di fluorescenza associata ad esso. La fluorescenza del reagente metabolico del colorante può essere sottratta dalla fluorescenza del campione di controllo e di prova prima di calcolare la vitalità % dei campioni di prova al controllo del supporto.</li>
	<li>Eseguire un test di normalità e un test per le varianze uguali sui campioni di controllo e test.</li>
	<li>Se il test di normalità supera e le varianze sono uguali, eseguire un ANOVA uni-way. Per identificare differenze significative tra gruppi specifici eseguire un test post hoc di confronti a coppie (ad esempio, i test di confronto multipli di Tukey o Dunnett).</li>
	<li>Se il test di normalità supera e le varianze sono diverse, eseguire l'ANOVA di Welch. Per identificare differenze significative tra gruppi specifici eseguire un test post hoc di confronti a coppie (ad esempio, test di confronto multipli di Dunnett o Games-Howell).</li>
	<li>Se il test di normalità non riesce, utilizzare un test non parametrico (cioè il test di Kruskal-Wallis). Per identificare differenze significative tra gruppi specifici eseguire un test post hoc di confronti a coppie (ad esempio, il test di Dunn).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes.">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li><li>Maurer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+acute+corneal+injury+in+rabbits+with+surfactants+of+different+type+and+irritancy.">Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).</li><li>Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+viability+reagent+PrestoBlue+in+comparison+with+alamarBlue+and+MTT+to+assess+the+viability+of+human+corneal+epithelial+cells.">Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).</li><li>Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O'Brien, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+alamar+blue+reduction+for+the+in+vitro+assay+of+hepatocyte+toxicity.">Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity.</a> Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).</li><li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells.">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li><li>Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lubricating+agents+differ+in+their+protection+of+cultured+human+epithelial+cells+against+desiccation.">Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation.</a> Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).</li><li>Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+artificial+tears+against+desiccation+in+cultured+human+epithelial+cells.">Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells.</a> Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).</li><li>Ubels, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+investigation+of+the+efficacy+of+an+artificial+tear+solution+containing+hydroxypropyl-guar+as+a+gelling+agent.">Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent.</a> Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).</li><li>Hovakimyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+protective+effects+of+trehalose+on+desiccation+of+epithelial+cells+in+three+dimensional+reconstructed+human+corneal+epithelium.">Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium.</a> Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).</li><li>Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+efficacy+of+ocular+surface+lubricants+against+dehydration.">In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration.</a> Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).</li><li>Matsuo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+protects+corneal+epithelial+cells+from+death+by+drying.">Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying.</a> British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+activated+NLRP3+inflammasomes+initiate+inflammation+in+hyperosmolarity+stressed+human+corneal+epithelial+cells+and+environment-induced+dry+eye+patients.">Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients.</a> Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+Effects+of+L-Carnitine+Against+Oxidative+Injury+by+Hyperosmolarity+in+Human+Corneal+Epithelial+Cells.">Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).</li><li>Schulze, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trefoil+factor+family+peptide+3+(TFF3)+is+upregulated+under+experimental+conditions+similar+to+dry+eye+disease+and+supports+corneal+wound+healing+effects+in+vitro.">Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).</li><li>Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air+quality+and+relative+humidity+in+commercial+aircrafts:+An+experimental+investigation+on+short-haul+domestic+flights.">Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights.</a> Building and Environment. 67, 69-81 (2013).</li><li>van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+seasonality+and+effects+of+psychrometry+in+dry+eye+disease.">Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).</li><li>Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+culture+media+and+deswelling+agents+on+survival+of+human+corneal+endothelial+and+epithelial+cells+in+vitro.">Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).</li><li>Zachari, M. 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Tre autori (Rekha Rangarajan, Howard A. Ketelson, Lakshman Subbaraman) sono dipendenti di Alcon. Alcon è l'unica fonte di finanziamento e sponsor di questo progetto. Lyndon W. Jones, negli ultimi 3 anni, ha ricevuto supporto alla ricerca o conferenze honoris causa dalle seguenti aziende: Alcon, Allergan, Contamac, CooperVision, GL Chemtec, Inflamax Research, J&J Vision, Menicon, Nature's Way, Novartis, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass e Visioneering. Lyndon Jones è anche consulente e/o fa parte di un advisory board per Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis e Ophtecs. La seguente lista di autori non ha nulla da rivelare: Richard Do, David J. McCanna, Adeline Suko, Daryl Enstone, Jaya Dantam.

Questo protocollo è progettato per determinare gli effetti protettivi delle soluzioni di strappo artificiale contro l'essiccazione cellulare. Inizialmente, le cellule sono esposte ai colliri secchi per rivestire le cellule. Successivamente, le cellule vengono essiccate e l'attività metabolica viene monitorata per valutare se le formulazioni possono mitigare gli effetti dannosi dello stress da essiccazione. Questi passaggi sono fondamentali per comprendere l'impatto complessivo che le formulazioni dell'occhio secco potrebbero avere sulla vitalità complessiva delle cellule epiteliali corneali.
Dopo che la maggior parte delle formulazioni dell'occhio secco sono state rimosse dai pozzi di coltura, la chimica delle molecole rimanenti che sono a contatto con le cellule avrà un impatto sull'essiccazione cellulare. Alcuni prodotti contengono micro-emulsioni di oli che riducono al minimo l'evaporazionecellulare 20. Uno studio che ha valutato l'analisi dell'attrito dopo il risciacquo ha mostrato il mantenimento di un basso attrito per alcune formulazioni dell'occhio secco che può essere un indicatore del tempo di residenza migliorato delle formulazioni dell'occhiosecco 21. Uno dei limiti di questo saggio è che, sebbene la protezione dall'essiccazione possa essere valutata rispetto ad altre formulazioni di colliri, la durata di questa protezione non può essere determinata a causa del breve tempo di asciugatura valutato. Tempi di essiccazione più lunghi in questo saggio in vitro possono richiedere l'uso di colture multistrato che hanno un contenuto complessivo di umidità maggiore rispetto a un monostrato cellulare.
I tempi di incubazione specifici per le formulazioni sulle cellule e la durata del tempo di asciugatura potrebbero dover essere regolati se i valori di temperatura e umidità vengono modificati. Selezionare una temperatura, un RH e un flusso d'aria per simulare condizioni di stress ambientale che possono contribuire all'occhio secco può essere difficile in quanto le condizioni ambientali stagionali e locali sonopiuttosto variabili 21. Le camere ambientali moderne per studi sull'uomo possono variare la temperatura tra 5 °C e 35 °C e RH tra il 5% e il 95%22. Utilizzando un evaporimetro e occhiali ben montati è stato determinato che a RH del 40−45% il tasso di evaporazione dalla cornea era di 0,037 μL/cm2/min e a RH del 20−25% il tasso di evaporazione era di 0,065 μL/cm2/min23. Se il modello in vitro sta esaminando l'effetto protettivo delle formulazioni in condizioni di RH estremamente basse come negli aerei15,deserti o ambienti interni asciutti16, i tempi di incubazione potrebbero dover essere ridotti per adattarsi ai tassi di evaporazione migliorati dalle cellule. Nel fluido lacrimale umano, sono presenti una varietà di lipidi derivati dal meibomio e da altre ghiandole che proteggono le lacrime dall'evaporazione. Questi lipidi hanno diversi punti di fusione24. Le variazioni di temperatura potrebbero influire sulla fluidità del fluido lacrimale, quindi le prove effettuate a temperatura ambiente potrebbero avere tassi di evaporazione significativamente diversi rispetto alle prove condotte a 37 °C. Poiché l'intervallo medio di temperatura della superficie oculare va da 32,9 a 36 °C25,si raccomanda di eseguire la prova vicino a questo intervallo di temperatura.
Oltre al colorante metabolico (alamarBlue) utilizzato in questo protocollo, ci sono altri reagenti chimici che possono essere utilizzati per valutare gli effetti delle formulazioni del prodotto sull'attività metabolica cellulare. I sali di tetrazolio (MTT, XTT, MTS, WST) sono sostanze chimiche alternative che possono essere utilizzate. La differenza nei sali di tetrazolio è che MTT è una molecola carica positivamente in modo che possa entrare nel citoplasma delle cellule viventi26. MTT diventa insolubile dopo la sua riduzione da parte di NAD(P)H27. Deve essere solubilizzato prima di leggere l'assorbanza su un lettore di lastre. Gli altri sali di tetrazolio sono caricati negativamente28. Devono essere ridotti da molecole secondarie al di fuori della cellula vivente perché non possono entrare nella cellula e interagire direttamente con le molecole intracellulari29. Per i test XTT, MTS e WST-1, l'aggiunta di un agente di accoppiamento elettronico 1-metossi fenazina methosulfato (PMS) può migliorare le prestazioni dei test30. A differenza dei test metabolici che utilizzano sali di tetrazolio, alamarBlue non richiede ulteriori agenti solubilizzanti o di accoppiamento elettronico. Inoltre, a differenza di XTT, MTS o WST-1, alamarBlue penetra nelle membrane cellulari e può essere ridotto direttamente dagli enzimicellulari 27,29. Il confronto diretto tra alamarBlue e sali di tetrazolio ha dimostrato che alamarBlue è più sensibile per valutare l'attività metabolica di varie linee cellulari tra cui HCEC3,27,31,32.
Altri endpoint biochimici possono anche essere considerati per valutare la protezione delle cellule epiteliali corneali umane per essiccazione. I coloranti fluorescenti possono essere utilizzati per rilevare la permeabilità della membrana cellulare e l'attività esterasecellulare 1. Inoltre, l'apoptosi può essere rilevata mediante colorazione per marcatori apoptotici sulla superficie cellulare o misurando per l'attività della caspasi1,33. Altri saggi hanno determinato gli effetti dei prodotti oftalmici sulle giunzioni strette HCEC34. Questi saggi potrebbero essere incorporati nelle valutazioni future utilizzando le procedure di essiccazione descritte in questo articolo.
Ci sono molte cause di occhio secco. L'occhio secco può essere causato da una diminuzione della secrezione di lacrime, da un aumento dell'infiammazione della superficie oculare o da una maggiore disidratazione sulla superficie oculare. Per gli individui che hanno l'uso evaporativo dell'occhio secco di una goccia d'occhio secca che impedisce alle loro cellule di asciugarsi durante le condizioni di essiccazione può alleviare i sintomi dell'occhio secco. Uno dei problemi in alcune formulazioni dell'occhio secco è la presenza di conservanti che possono danneggiare la superficie oculare. Le cellule che feriscono non sono utili ai pazienti con occhio secco in quanto possono causare la morte di più cellule poiché le cellule ferite sono più suscettibili allo stress da essiccazione35.
Un recente articolo di revisione di Garrigue et al. L'aggiunta di lipidi a lacrime carenti di lipidi può prevenire l'evaporazione, proteggendo così le cellule dall'essiccazione. Inoltre, gli umettanti sono molecole che attraggono e trattengono l'acqua sulla superficieoculare 37. Sia la glicerina in soluzione #1 il glicole propilenico in soluzione #3 sono umettanti. La #3 ha mostrato un maggiore effetto protettivo dell'HCEC che potrebbe essere dovuto alle proprietà lipidiche e umectanti degli ingredienti della formulazione.
Questo protocollo è progettato per valutare l'attività metabolica dell'HCEC dopo l'esposizione alle formulazioni dell'occhio secco e allo stress da essiccazione. Utilizzando i metodi descritti in questo articolo, è possibile sviluppare nuovi colliri nonirritating e protettivi per le persone che soffrono di occhio secco evaporativo.

Sono necessari molti ingredienti diversi in soluzioni oftalmiche a dosi multiple per mantenere stabilità, pH, osmolarità ed efficacia. Tuttavia, alcune sostanze chimiche come conservanti o tensioattivi in soluzioni oculari possono causare danni all'epitelio corneale1,2. I test di vitalità cellulare che utilizzano cellule epiteliali corneali umane (HCEC) possono essere eseguiti per valutare i potenziali danni causati da questi vari ingredienti nelle formulazioni oftalmiche. Uno dei saggi in vitro particolarmente utili per valutare il danno cellulare è il saggio alamarBlue3. In questo saggio, il colorante metabolico (cioè alamarBlue) contiene resazurina, che funziona come indicatore di vitalità cellulare. Durante la respirazione cellulare, la resazurina viene ridotta a risorufina accettando elettroni4. La riduzione della risorufina provoca un cambiamento da una molecola non fluorescente a una molecola fluorescente che può essere rilevata utilizzando uno spettrofluorometro5.
Questa indagine utilizza due diversi trattamenti delle cellule epiteliali corneali per determinare come possono funzionare i prodotti per gli occhi secchi in un modello in vitro. Nella prima valutazione, le cellule vengono trattate con questi prodotti per 30 minuti. Dopo il trattamento, le cellule vengono quindi valutate per l'attività metabolica immediatamente dopo l'esposizione ai prodotti per l'occhio secco e dopo un intervallo di tempo di recupero. Questa valutazione determina l'effetto di questi prodotti sulle cellule prima dell'essiccazione in una camera di umidità. Conservanti della soluzione, tensioattivi o tamponi in queste soluzioni possono avere alcuni effetti citotossici sulle cellule che possono essere rilevati utilizzando il colorante metabolico.
La seconda valutazione determina l'attività metabolica delle cellule dopo l'esposizione ai prodotti per l'occhio secco e l'essiccazione. In questa valutazione, se il trattamento del prodotto offre protezione alle cellule dai danni da essiccazione, l'attività metabolica delle cellule verrà mantenuta. La protezione cellulare dagli effetti dannosi dell'essiccazione può verificarsi se il prodotto per gli occhi secchi può rivestire le cellule con lipidi o il prodotto può assorbire liquido dall'ambiente circostante aggiungendo umidità alle cellule.
Questo protocollo è progettato per simulare gravi condizioni di stress ambientale sulle cellule. Altri studi hanno utilizzato vari modelli per creare questo stress esterno. Alcuni studi hanno asciugato le cellule nelle cappe a flusso laminare6,7,8 ,mentrealtri hanno utilizzato la temperatura ambiente e vari valori di umidità relativa (RH)9,10,11. Un metodo per simulare le condizioni dell'occhio secco è aumentare l'osmolarità dellasoluzione incubatrice 12,13. Un altro metodo in vitro per simulare condizioni ambientali avverse è quello di aggiungere citochine al supporto cellulare per simulare il fluido lacrimale dei pazienti con occhio secco14. Sebbene questi test siano modelli interessanti in grado di valutare come le sostanze chimiche riducono lo stress osmotico o stimolano il sistema immunitario, questi modelli non mostrano direttamente come le formulazioni chimiche possano proteggere le cellule dallo stress da essiccazione.
Il modello di essiccazione utilizza una camera di temperatura/umidità 37 °C e 45% RH. Simula condizioni ambientali che possono causare evaporazione dalla superficie oculare. Simulazioni di altre condizioni ambientali estreme come la bassa umidità presente nelle cabine degli aerei15 o in ambienti interni durante imesi invernali 16 possono anche essere eseguite utilizzando questo metodo.
La modellazione della coltura cellulare viene utilizzata per simulare l'effetto dello stress da essiccazione sulla cornea umana. Al fine di rilevare lo stress cellulare, vengono effettuati test di vitalità cellulare per determinare l'impatto sulla salute delle cellule. Diverse prove fisiologiche possono essere eseguite sulle cellule per determinare se sono stressate17. L'analisi eseguita in questa procedura di prova utilizza il colorante metabolico disponibile in commercio(Tabella dei materiali). Ha il vantaggio rispetto a molti altri stress test cellulari in quanto non è tossico, solubile nei mezzi di crescita e può valutare le cellule senza fissazione cellulare18. In questa procedura le cellule vengono testate per l'attività metabolica immediatamente dopo ogni trattamento e una seconda serie di cellule viene riposta in mezzi di crescita e valutata dopo un recupero di 18 ore. Il motivo del test immediatamente e poi dopo un periodo di recupero è identificare i danni cellulari che causano effetti immediati sull'attività metabolica e sui danni cellulari che causano effetti ritardati. Inoltre, offre l'opportunità di valutare l'impatto di queste formulazioni sui danni a breve e lungo termine e la capacità delle formulazioni di riprendersi / non riprendersi dall'insulto iniziale.
Questa indagine viene utilizzata per confrontare vari prodotti per l'occhio secco contenenti lipidi per il loro effetto sull'attività metabolica dell'HCEC con e senza essiccazione. Gli ingredienti nei prodotti per occhio secco testati sono descritti in Table of Materials. Gli ingredienti in soluzione #1 sono carbossimetilcellulosa sodio (0,5%), glicerina (1%) e polisorbato 80 (0,5%), in soluzione #2 sono olio minerale leggero (1,0%) e olio minerale (4,5%), e in soluzione #3 lipide è olio minerale e il glicole propilenico è il demulcente. Questi lipidi sono i componenti di formulazione che dovrebbero fornire protezione dell'HCEC dall'essiccazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>75 cm2 Vented Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354485</td>
			<td>This is the BioCoat brand collagen coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dal 1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 48 Well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354505</td>
			<td>This is the BioCoat brand collagen coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>CYT5MPV</td>
			<td>Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>There is No Phenol Red in this media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hycone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Corneal Epithelial Cells</td>
			<td>University of Ottawa</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169&#8211;72.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity/Temperature Chamber</td>
			<td>Associated Environmental Systems</td>
			<td>LH-1.5</td>
			<td>Economy Line Humidity Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100X concentration so add 1ml to each 99ml of media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Optive Advanced (solution #1)</td>
			<td>Allergan, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soothe XP (solution #2)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td>Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Complete (solution #3)</td>
			<td>Alcon Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD&#174; (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express (cell disassociation solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12605036" target="_blank">12605036</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of artificial tear formulations on the metabolic activity of human corneal epithelial cells after exposure to desiccation

Le formulazioni lacrimali artificiali contenenti lipidi sono sviluppate per ridurre l'evaporazione lacrimale mediante il ripristino di uno strato lipidico lacrimale carente. Formulazioni lacrimali artificiali che prevengono l'essiccazione cellulare si tradurranno in una protezione oculare della superficie e nel mantenimento dell'attività metabolica cellulare. Durante la disidratazione, le cellule subiscono il processo di perdita dell'attività metabolica e successivamente di morte cellulare. Questo lavoro descrive un metodo per valutare l'efficacia delle formulazioni di lacrima artificiale. Il colorante metabolico (cioè alamarBlue) passa da una bassa molecola fluorescente che rivende a una molecola fluorescente che rivendifine in cellule vitali. Le prestazioni biologiche di una formulazione lacrimale artificiale sono misurate come capacità della formulazione di (a) mantenere la vitalità cellulare e (b) fornire protezione cellulare dall'essiccazione. I mezzi di crescita e la salina vengono utilizzati come controlli per i test di vitalità/essiccazione cellulare. Le cellule vengono incubate con soluzioni di prova per 30 minuti e quindi essiccate per 0 o 5 min a 37 °C e al 45% di umidità relativa. L'attività metabolica cellulare dopo l'esposizione iniziale e dopo l'essiccazione cellulare viene quindi determinata. I risultati mostrano gli effetti comparativi delle formulazioni di colliri sull'attività metabolica cellulare e sulla protezione dall'essiccazione. Questo metodo può essere utilizzato per testare formulazioni dell'occhio secco progettate per trattare individui con occhio secco evaporativo.

I risultati di uno studio che confronta tre formulazioni dell'occhio secco sono riportati nella figura 1. Questa figura mostra che vi sono differenze nell'effetto che i tre prodotti, la soluzione #1, la soluzione #2 e la soluzione #3(Tabella dei materiali)hanno sulla vitalità dell'HCEC. La #1 e la #2 hanno avuto un effetto significativo sull'attività metabolica dell'HCEC prima dell'essiccazione. Ciò significa che ci sono componenti di formulazione in questi prodotti che possono interrompere l'attività metabolica dell'HCEC. L'ulteriore calo dell'attività metabolica cellulare verificatosi dopo il recupero di 18 ore delle cellule esposte alla soluzione #1 mostra che l'HCEC è stato ferito inizialmente e dopo 18 ore la lesione non è stata riparata. In confronto, la #3 ha avuto solo un lieve effetto sull'attività metabolica dell'HCEC.
La figura 2 mostra l'effetto di queste formulazioni di occhi secchi contenenti lipidi sulla protezione cellulare. Con un'attività metabolica HCEC vicina allo 0% all'intervallo di recupero di 18 ore, la soluzione #1 e la soluzione #2 non proteggevano le cellule dallo stress da essiccazione. La #3, tuttavia, offriva una certa protezione contro lo stress da essiccazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig1.jpg"> Figura 1: Effetto dei prodotti potenziati dai lipidi dell'occhio secco sulla vitalità cellulare. Vitalità relativa misurata dall'attività metabolica HCEC dopo il trattamento con prodotti per l'occhio secco contenenti lipidi. * = significatività statistica (p < 0,05) rispetto alla soluzione #3, Δ = significatività statistica (p < 0,05) relativa al controllo dei supporti per il periodo di recupero appropriato. L'altezza della barra rappresenta il valore medio e le barre di errore sono l'SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60812/60812fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60812/60812fig2.jpg"> Figura 2: Effetto dei prodotti potenziati dai lipidi dell'occhio secco sulla protezione dall'essiccazione. Effetto delle formulazioni dell'occhio secco contenenti lipidi sulla protezione cellulare. La #1 e la #2 non proteggevano le cellule dallo stress da essiccazione e non si riprendevano dagli effetti di essiccazione nel tempo. Al contrario, la soluzione #3 offerto una certa protezione contro lo stress da essiccazione. * = p < 0,05 rispetto alla soluzione #3, e Δ = p < 0,05 rispetto ai supporti non trattati (controllo) per il tempo di recupero appropriato. L'altezza della barra rappresenta il valore medio e le barre di errore sono l'SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60812/60812fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Lo scopo di questo protocollo è valutare se diverse formulazioni di lacrimazione artificiale possono proteggere le cellule epiteliali corneali umane dall'essiccazione utilizzando un modello in vitro. Dopo l'esposizione a formulazioni lacrimali artificiali e all'essiccazione, le cellule epiteliali corneali umane vengono valutate per l'attività metabolica.

Effetto delle formulazioni lacrimali artificiali sull'attività metabolica delle cellule epiteliali corneali umane dopo l'esposizione all'essiccazione

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

effect-artificial-tear-formulations-on-metabolic-activity-human

Research

JoVE Journal

Medicine

3.7K Views.  Alcon Vision, LLC. Lo scopo di questo protocollo è valutare se diverse formulazioni di lacrimazione artificiale possono proteggere le cellule epiteliali corneali umane dall'essiccazione utilizzando un modello in vitro. Dopo l'esposizione a formulazioni lacrimali artificiali e all'essiccazione, le cellule epiteliali corneali umane vengono valutate per l'attività metabolica.

Video: Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated respiratory epithelium. A protocol is described for isolating and exposing these cells to mainstream cigarette smoke (CS), in order to study epithelial cell responses to CS exposure. The protocol consists of three parts: the isolation of airway epithelial cells from mouse trachea, the culturing of these cells at air-liquid interface (ALI) as fully differentiated epithelial cells, and the delivery of calibrated mainstream CS to these cells in culture. The ALI culture system allows the culture of respiratory epithelia under conditions that more closely resemble their physiological setting than ordinary liquid culture systems. The study of molecular and lung cellular responses to CS exposure is a critical component of understanding the impact of environmental air pollution on human health. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the etiology of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and other tobacco-related diseases, which represent major global health problems.

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface as a model of differentiated respiratory epithelium. A protocol is described for isolating, culturing and exposing these cells to mainstream cigarette smoke, in order to study molecular responses to this environmental toxin.

Isolamento di mouse cellule epiteliali delle vie respiratorie ed esposizione al fumo di sigaretta Sperimentale interfaccia Air Liquid

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Ricerca

Medicina

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

Formazione di epitelio prostatico umano utilizzando tessuti ricombinazione dei roditori urogenitale Mesenchima Sinus e cellule staminali umane

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective mining of the information in the large-scale datasets that are obtained from gene expression microarrays, deep sequencing experiments or metabolic profiling is essential to uncover and then effectively target the critical regulators of diseased cell phenotypes. Estrogen Receptor &#945; (ER&#945;) is one of the master transcription factors regulating the gene programs that are important for estrogen responsive breast cancers. In order to understand to role of ER&#945; signaling in breast cancer metabolism we utilized transcriptomic, cistromic and metabolomic data from MCF-7 cells treated with estradiol. In this report we described generation of samples for RNA-Seq, ChIP-Seq and metabolomics experiments and the integrative computational analysis of the obtained data. This approach is useful in delineating novel molecular mechanisms and gene regulatory circuits that are regulated by a particular transcription factor which impacts metabolism of normal or diseased cells.

Integration of data from genome-wide sequencing experiments and metabolomics experiments is a challenge. In this paper we report, for the first time, generation, analysis and integration of transcriptome, cistrome and metabolome data from breast cancer cells treated with estradiol.

Systems Biology di regolazione metabolica da Estrogen Receptor Signaling nel cancro al seno

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or in buffer (washed platelets), by the use of one or a combination of agonists. The use of washed platelets separated from their plasma environment and in the absence of anticoagulants allows for studying intrinsic platelet properties. Among the large panel of agonists, arachidonic acid (AA), adenosine di-phosphate (ADP), thrombin and collagen are the most frequently used. The aggregation response is quantified by measuring the relative optical density (OD) over time of platelet suspension under continuous stirring. Platelets in homogeneous suspension limit the passage of light after the addition of an agonist, platelet shape change occurs producing a small transitory increase in OD. Following this initial activation step, platelet clots form gradually, allowing the passage of light through the suspension as a result of decreased OD. The aggregation process is ultimately expressed as a percentage, compared to the OD of platelet-poor plasma or buffer. Rigorous calibration is thus essential at the beginning of each experiment. As a general rule: calibration to 0% is set by measuring the OD of a non-stimulated platelet suspension while measuring the OD of the suspension medium containing no platelets represents a value of 100%. Platelet aggregation is generally visualized as a real-time aggregation curve. Turbidimetry is one of the most commonly used laboratory techniques for the investigation of platelet function and is considered as the historical gold standard and used for the development of new pharmaceutical agents aimed at inhibiting platelet aggregation. Here, we describe detailed protocols for 1) preparation of human washed platelets and 2) turbidimetric analysis of collagen-induced aggregation of human washed platelets pretreated with the food dye Brilliant Blue FCF that was recently identified as an inhibitor of Pannexin1 (Panx1) channels.

We describe a straightforward method for the isolation of washed platelets from human blood followed by agonist-induced platelet aggregation measurements by turbidimetry. As an example we apply this method for studying the aggregation response of human platelets to collagen after a pre-incubation with the Pannexin1 channel inhibitor Brilliant Blue FCF.

Turbidimetria su Human Lavato Piastrine: l&#39;effetto della Pannexin1-inibitore blu brillante FCF sul livello di aggregazione indotta dal collagene

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be attributed to, in part, the dysregulation of autophagy. Aberrant changes in the expression of autophagy regulators in the placentas from obese pregnancies may be regulated by inflammatory processes associated with both obesity and pregnancy. Described here is a protocol for sampling of villous tissue and isolation of villous cytotrophoblasts from the term human placenta for primary cell culture. This is followed by a method for simulating the inflammatory milieu in the obese intrauterine environment by treating primary trophoblasts from lean pregnancies with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;), a proinflammatory cytokine that is elevated in obesity and in pregnancy. Through the implementation of the protocol described here, it is found that exposure to exogenous TNF&#945; regulates the expression of Rubicon, a negative regulator of autophagy, in trophoblasts from lean pregnancies with female fetuses. While a variety of biological factors in the obese intrauterine environment maintain the potential to modulate critical pathways in trophoblasts, this ex vivo system is especially useful for determining if expression patterns observed in vivo in human placentas with maternal obesity are a direct result of TNF&#945; signaling. Ultimately, this approach affords the opportunity to parse out the regulatory and molecular implications of inflammation associated with maternal obesity on autophagy and other critical cellular pathways in trophoblasts that have the potential to impact placental function.

Presented here is a protocol for sampling of human placental villous tissue followed by isolation of cytotrophoblasts for primary cell culture. Treatment of trophoblasts with TNF&#945; recapitulates inflammation in the obese intrauterine environment and facilitates the discovery of molecular targets regulated by inflammation in placentas with maternal obesity.

Un modello di trofoblasto umano primario per studiare l'effetto di infiammazione associata con l'obesità materna sulla regolazione dell'autofagia nella Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

Un modello murino di esposizione fetale all'infiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite acuta sullo sviluppo intestinale appena nato

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its transparency. However, due to its external position, the cornea is highly susceptible to a wide variety of injuries that can lead to the loss of corneal transparency and eventual blindness. Efficient corneal wound healing in response to these injuries is pivotal for maintaining corneal homeostasis and preservation of corneal transparency and refractive capabilities. In events of compromised corneal wound healing, the cornea becomes vulnerable to infections, ulcerations, and scarring. Given the fundamental importance of corneal wound healing to the preservation of corneal transparency and vision, a better understanding of the normal corneal wound healing process is a prerequisite to understanding impaired corneal wound healing associated with infection and disease. Toward this goal, murine models of corneal wounding have proven useful in furthering our understanding of the corneal wound healing mechanisms operating under normal physiological conditions. Here, a protocol for creating a central corneal epithelial abrasion in mouse using a trephine and a blunt golf club spud is described. In this model, a 2 mm diameter circular trephine, centered over the cornea, is used to demarcate the wound area. The golf club spud is used with care to debride the epithelium and create a circular wound without damaging the corneal epithelial basement membrane. The resulting inflammatory response proceeds as a well-characterized cascade of cellular and molecular events that are critical for efficient wound healing. This simple corneal wound healing model is highly reproducible and well-published and is now being used to evaluate compromised corneal wound healing in the context of disease.

Here, a protocol for creating a central corneal epithelial abrasion wound in the mouse using a trephine and a blunt golf club spud is described. This corneal wound healing model is highly reproducible and is now being used to evaluate compromised corneal wound healing in the context of diseases.

Un modello di abrasione epiteliale per lo studio della guarigione delle ferite corneali

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Protocollo Tuina standardizzato per il modello di compressione DRG per ratti

Analgesic Effect of Tuina on Rat Models with Compression of the Dorsal Root Ganglion Pain

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar disc herniation, spinal canal stenosis, and intervertebral foramen stenosis. Although Tuina, a traditional Chinese manual therapy, has shown analgesic effects in clinical practice for the treatment of neuropathic pain, its underlying neurobiological mechanisms remain unclear. Animal models are essential for elucidating the basic principles of Tuina. In this study, we propose a standardized Tuina protocol for rats with compression of the dorsal root ganglion (DRG), which involves inducing DRG compression by inserting a stainless steel rod into the intervertebral foramen, performing Tuina manipulation with specific parameters of location, intensity, and frequency in a controlled environment, and assessing the behavioral and histopathological outcomes of Tuina treatment. This article also discusses the potential clinical implications and limitations of the study and suggests directions for future research on Tuina.

Autore in primo piano: Effetto analgesico di Tuina su modelli di ratto con compressione del dolore al ganglio della radice dorsale  

This article presents a manipulation for treating chronic compression of the dorsal root ganglion in rats using Tuina therapy, along with a method for evaluating its effectiveness based on pain behavior and histopathological results.

Effetto analgesico di Tuina su modelli di ratto con compressione del dolore al ganglio della radice dorsale

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar ...