Artan kanıtlar fizyolojinin kolon parçası üzerinde östrojen sinyalin etkisini göstermektedir, immünohistokimya kolon östrojen reseptörlerini tanımlamak için umut verici bir tekniktir ve kolit haline gelişir. Biz kolon östrojen reseptörlerinin immünohistokimyasal görselleştirme için tam ve doğrulanmış bir protokol salıyoruz, immünoresans kullanarak. Lodz Üniversitesi Mikroskobik Görüntüleme Laboratuvarı'ndan Dr.Sylwia Michlewska ile birlikte prosedürü göstereceğiz.
Bir petri kabına kolon yerleştirin. Bir ila iki santimetre parçalar halinde kolon kesin. Her parçayı uygun şekilde etiketlenmiş histolojik bir kasete süngerin üzerine yerleştirin.
%4 paraformaldehit içinde kolon parçası içeren bir kaset yerleştirin. En az 24 saat 4 santigrat derecede kuluçkaya yat. 50%70%90%95 ve %100 etanol, ksilen %100 etanol ve sadece ksilen ve sıvı parafinde en az üç saatlik kuluçka için doku işlemcisini bir saatlik kuluçka için hazırlayın ve programlayın.
Kolon parçasını histolojik bir kutuya aktarın. Kutuyu önceden programlanmış doku işlemcisine yerleştirin ve işlemciyi çalıştırın. Doku işlemci içinde kuluçka sonra histolojik kutusundan kolon kaldırmak ve bir metal kalıp kolon parçası yerleştirin, kolon iki ucu dik bir konumda olduğu gibi.
Kalıbın üçte birini sıvı parafinle doldurun. Birkaç saniye için eksi beş derece santigrat de soğutma alanında kalıp yerleştirin ve sonra 70 santigrat derece De ısınma alanına kalıp hareket ettirin. Sonra histolojik kutunun alt kısmına kalıp yerleştirin ve sıvı parafin ile tüm kolon parçası kapağı.
Birkaç dakika için soğutma alanında kolon parçası ve parafin içeren metal kalıp yerleştirin. Sonra kolon ve parafin blok metal kalıp kaldırın. Kolon ve parafin bloğunu en az 24 saat boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, bloktaki fazla parafini çıkarın. Kolon ve parafin bloğunu tam otomatik bir döner mikrotome yerleştirin. Kolon parçasını beş mikrometrekesite kesin.
Bir kolon bölümünü önceden ısıtılmış 40 dereceye kadar su banyosuna aktarın. Su banyosundan kolon bölümünü kaldırmak ve 24 saat oda sıcaklığında cam slayt kuluçka yadamak için etiketli cam slayt kullanın. İlk olarak, beş dakika ksilen cam slayt kuluçka parafin çıkarın.
Bu adımı üç kez tekrarlayın. Daha sonra cam kaydırağı beş dakika boyunca bire bir ksilen ve %100 etanol karışımına yerleştirin. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
Kolon bölümünü rehydrate için azalan etanol konsantrasyonları bir dizi kullanın. Beş dakika boyunca etanol slayt batırın. Bir sonraki konsantrasyona geçmeden önce her konsantrasyonda üç kez tekrarlayın.
Cam kaydırağı akan suyun altında beş dakika durulayın. Antijen alma tamponu 95 ila 98 santigrat dereceye ısıtın. Sonra 10 dakika kaynar antijen alma çözeltisi cam slayt ısıtın.
Reaktiflerin israfını önlemek için, kolon bölümü etrafında bir daire çizmek için bir hidrofobik kalem kullanın. Daha sonra, hidrojen peroksidaz ve su% 3 çözeltisi içinde 10 dakika boyunca slayt kuluçka. Beş dakika boyunca yıkama çözeltisi slayt yıkayın.
Daha sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca engelleme çözeltisi slayt kuluçka. Engelleme çözeltisini çıkarın ve E-R alfa, E-R beta veya seyreltilmiş G-P-E-R'a karşı 20 ila 50 mikrolitre primer antikor ekleyin. Ana antikorbir gecede karanlıkta dört derece yekpülatörde kuluçkaya yatırın.
Antikor solüsyonunu çıkarın. Her seferinde beş dakika boyunca yıkama çözeltisinde kaydırağı üç kez yıkayın. Sonra, seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin.
Karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boya ile konjuge ikincil antikor ile slayt kuluçka. İkincil antikor solüsyonu slayttan çıkarın. Her seferinde beş dakika boyunca yıkama çözeltisinde kaydırağı üç kez yıkayın.
Membran görselleştirme silüasyon için seyreltilmiş florokrom ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka. Çözeltiyi çıkarın ve her seferinde beş dakika boyunca kaydırağı üç kez yıkayın. Gliserol bazlı sıvı DAPI birkaç damla ekleyin, hücre çekirdeği görselleştirme için bir florokrom, doğrudan kolon bölümünde.
Bir kapak slayt ile dikkatlice kaplayın. Kolon kısmını en az 24 saat boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. 20x veya 63x hedefleri ve yağ daldırma içeren bir konfokal mikroskop altında kolon bölümü analiz edin.
Çalışmada kullanılan antikorların özgüllüğü MCF-7 hücreleri kullanılarak doğrulandı. Östrojen reseptör antikorları nükleer östrojen reseptörlerinin E-R alfa ve E-R beta yanı sıra membranbağlı östrojen reseptörü G-P-E-R tespiti sağladı. Negatif kontrol de mcf-7 hücreleri sadece ikincil antikor florokrom ve DAPI ile gliserol bazlı sıvı ile boyanmış olduğu yapıldı.
Kontrol farelerinden ve TNBS'ye bağlı Crohn hastalığına bağlı farelerden elde edilen kolon bölümlerinde güçlü bir E-R alfa sinyali bulundu. Ancak, sadece kontrol farelerinden elde edilen kolonlarda goblet hücresi sitoplazmasında E-R alfası lokalize edildi. Konfokal mikroskopide hem kontrol hem de TNBS ile tedavi edilen farelerin kolon kesitlerinde E-R betanın sitoplazmik lokalizasyonu saptandı.
Benzer şekilde, kontrol farelerinden ve TNBS ile tedavi edilen farelerden elde edilen kolon bölümlerinde G-P-E-R'ın sitoplazmik lokalizasyonu belgelenmiştir. Kalıp içinde kolon doğru konumlandırma doğru kesit oluşturmak için esastır. Florokrom kendi uyarma ve emisyon spektrumu ile seçilmelidir.
Bu yöntem kolit gelişiminde rol abilecek diğer proteinlere de uygulanabilir. İmmünofloresan ile immünohistokimya tespiti protein-protein yönü durumundaki diğer proteinleri lekelemek için uzatılabilir.
