Metabolit genom ortamı ve yönetim uygulamaları gibi faktörlerden etkilenir. Bu faktörler arasındaki etkileşimleri anlamak, bir ürünün veriminin ve kalitesinin daha doğru tahmin ve yönetilmesine olanak sağlayabilir. Geleneksel iki yerine üçüncü bir mobil faz birleştirerek, bu teknik ayrım ve metabolitlerin daha geniş bir yelpazede algılama sağlar.
Metabolomik biyolojinin herhangi bir alanına uygulanabilir. İlk olarak, bir organizmanın biyokimyadaha derin bir anlayış elde etmek için, ve fizyolojisi ile ilgili olarak abiyotik veya biyotik strese yanıt açıklamaya yardımcı olur. İkinci olarak, biyobelirteçleri çalışma aşamasındaki tedirginlikle ilişkilendirmek.
İzopropil alkol viskoz bir çözücü olduğu için, düşük parlama hızında kullanılmalı ve kompozisyonu %98'e artırmadan önce kullanılan yeterli denge süresi Bu adımlar kromatik grafik sisteminin aşırı basınçlanmasını, hata dönmesini veya analitik kolona zarar vermesini önleyecektir. Tanelerin hazırlanmasına başlamak için, tahıl öğütmek için bir laboratuvar blender kullanın. Blender'ı 20 saniye yüksek hızda çalıştırın ve tekrarlayın.
Blender kavanozu tabandan çıkarın. Numunenin yüzeyine herhangi bir kaba öğütülmüş tane getirmek için blender kavanozunun yan tarafına dokunun. Kaba öğütülmüş tahıl atılabilir veya depolanabilir.
İnce öğütülmüş tahılı blender'dan iki mililitrelik plastik mikro santrifüj tüpe aktarın. Çıkarma işlemiyle aynı gün, el yazmasında açıklandığı gibi ekstraksiyon çözücüsi hazırlayın. Sonra, iki mililitrelik mikro santrifüj tüp içine ince öğütülmüş tahıl 200 miligram ağırlığında.
Tüpteki tahıla 500 mikrolitre ekstraksiyon çözücüekleyin. Buna ek olarak, boş bir tüpe 500 mikrolitre ekstraksiyon çözücü satarak boş bir boş hazırlayın. 6, 500 RPM olarak ayarlanmış bir homogenizer kullanarak, 20 saniye boyunca çözücü ve tahıl karıştırın.
Sonra, başka bir 20 saniye için tekrarlayın. Sonra, tüpü dört santigrat derecede ve 16, 100 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Supernatant'ı iki mililitrelik plastik bir tüpe aktarın ve peleti koruyun.
Pelet üzerindeki ekstraksiyon işlemini iki kez tekrarlayın. Yaklaşık 1,5 mililitre toplam ekstre hacmi verim ve girdap tarafından karıştırın, üç supernatants birleştirin. Kalite kontrolü için kullanılacak tüm tane ekstrelerinin havuzlu bir örneğini yapmak için, her tane ekstresinin 55 mikrolitresini iki mililitrelik bir tüp ve girdap aktarın.
Daha sonra, bu havuzlu numunenin 50 mikrolitrelik aliquotlarını cam şişelere aktarın. Her tane numune ekstresinin 50 mikrolitrelik aliquot'unun cam şişelere aktarılması. Yazılı el yazmasında açıklandığı gibi, sıvı kromatografi kütle spektrometresi için gerekli olacak çözümleri hazırlayın.
LCMS analizi nin olduğu gün, mililitre liucine enkephalin başına 200 nanogram içeren 100 mililitre %5 asetonitil hazırlayın. Tahıl ekstresinin 50 mikrolitrelik aliquot'unu içeren cam şişeye bu çözeltinin 950 mikrolitresini ekleyin. Girdap tarafından şişe içinde içeriğini karıştırın.
İlk olarak, el yazmasıve üreticinin kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi aletleri kalibre ayarlayın. Daha sonra, mobil faz ve yıkama çözücüleri de dahil olmak üzere LCMS sınıfı çözücüler kullanarak LC akışkan sistemini temizleyip temizle. LC sistemini LC yöntemiyle dengeleyin ve kolon basıncının dengelenmesini sağlar.
Enstrüman sıra tablosunu ayarlayın. Cihaz kalibrasyonunun kontrol edilebiyi kontrol etmek için numune dizisinin başında sodyum formatı enjekte edin. Önce çözücü ve preparative boşlukları analiz edin, ardından sistem koşullandırması için havuzlu kalite kontrol örnekleri ve ardından randomize örnek listesi.
Teknik çoğaltmalar gibi, düzenli aralıklarla kalite kontrol örnekleri çalıştırın. Dizinin sonunda iki kalite kontrol örneği çalıştırın. Dizi çalışırken, hem dahili standart kütle doğruluğu hem de sinyal tekrarlanabilirliği de dahil olmak üzere veri kalitesini kontrol edin.
Sinyal tekrarlanabilirliğini kontrol etmek için, overlaid spectra görsel muayene yeterli olmalıdır. Tahıl özlerinin hazırlanmasında kullanılan çözeltiye dört iç standart dahil edildi. LCMS sırasında hem pozitif hem de negatif iyonizasyon modları için iyi kütle doğruluğu ve iç standartların tek tekrarlanabilirliği gözlendi.
Boşlukların analizine göre negatif modda 421, pozitif modda 835 sinyal eser olarak değerlendirildi. Bu sinyaller, tane örneklerindeki ortalama tek şiddetin %5'ine eşit veya daha büyük yoğunluklarda boşluklar halinde mevcuttu. Yapılar kaldırıldıktan ve verilerin daha fazla filtreledikten sonra negatif mod 483 özellik döndü ve pozitif mod 523 özelliği döndürmüştür.
Yaklaşık 250 özellik biyolojik olarak ilgiliydi ve buğday çeşitleri arasında yoğunluk açısından önemli ölçüde farklılık gösterebildi. Bu protokolde, preparatif boşlukların, iç standartların ve havuzlu örneklerin dahil edilmesi gibi kalite kontrol önlemleri unutulmaması gereken öneme açıktır.
