El metabolito está influenciado por factores como el entorno del genoma y las prácticas de gestión. Comprender las interacciones entre estos factores podría permitir una predicción y gestión más precisas del rendimiento y la calidad de un producto. Al incorporar una tercera fase móvil, en lugar de las dos tradicionales, esta técnica permite la separación y detección de una gama más amplia de metabolitos.
La metabolómica podría aplicarse a cualquier área de la biología. En primer lugar, lograr una comprensión más profunda de la bioquímica de un organismo, y ayudar a explicar su respuesta al estrés abiótico o biótico en relación con la fisiología. En segundo lugar, asociar biomarcadores con la perturbación en estudio.
Como el alcohol isopropílico es un disolvente viscoso, debe introducirse a baja tasa de destellos, y se debe utilizar suficiente tiempo de equilibrio antes de aumentar la composición al 98%Estos pasos evitarán que el sistema gráfico cromático prequiñe en exceso, devuelva un error o potencialmente dañe la columna analítica. Para comenzar la preparación de los granos, utilice una licuadora de laboratorio para moler el grano. Ejecute la licuadora a alta velocidad durante 20 segundos y repita.
Retire el frasco de la licuadora de la base. Toque el lado del frasco de la licuadora para llevar cualquier grano de tierra gruesa a la superficie de la muestra. El grano de tierra gruesa se puede desechar o almacenar.
Transfiera el grano finamente molido de la licuadora a un tubo de micro centrífuga de plástico de dos mililitros. El mismo día de la extracción, prepare el disolvente de extracción, como se describe en el manuscrito. A continuación, pesa 200 miligramos de grano finamente molido en un tubo de micro centrífuga de dos mililitros.
Añadir 500 microlitros de disolvente de extracción al grano en el tubo. Además, prepare un espacio en blanco añadiendo 500 microlitros de disolvente de extracción a un tubo vacío. Con un homogeneizador, ajustado a 6.500 RPM, mezcle el disolvente y el grano durante 20 segundos.
A continuación, repita durante otros 20 segundos. Luego, centrifuga el tubo a cuatro grados centígrados y 16, 100 veces G, durante cinco minutos. Transfiera el sobrenadante a un tubo de plástico de dos mililitros y conserve el pellet.
Repita el proceso de extracción en el pellet dos veces. Combine los tres sobrenadantes, produciendo un volumen total de extracto de aproximadamente 1,5 mililitros y mezcle por vórtice. Para hacer una muestra agrupada de todos los extractos de grano que se utilizarán para el control de calidad, transfiera 55 microlitros de cada extracto de grano a un tubo de dos mililitros y vórtice.
A continuación, transfiera 50 microlitros alícuotas de esta muestra agrupada a viales de vidrio. Transfiera una alícuota de 50 microlitros de cada extracto de muestra de grano a viales de vidrio. Como se describe en el manuscrito escrito, prepare las soluciones que serán necesarias para la espectrometría de masas de cromatografía líquida.
El día del análisis de LCMS, preparar 100 mililitros de 5%acetonitrilo, que contiene 200 nanogramos por mililitro de leucina enkephalin. Añadir 950 microlitros de esta solución al vial de vidrio que contiene la alícuota de 50 microlitros del extracto de grano. Mezclar el contenido en el vial por vórtice.
En primer lugar, configure un calibrar los instrumentos como se describe en el manuscrito y la guía del usuario del fabricante. A continuación, purgue y enjuague el sistema de fluidos LC con disolventes de grado LCMS, incluidos los disolventes móviles de fase y lavado. Equilibre el sistema LC utilizando las condiciones de inicio del método LC, asegurando que la presión de la columna se haya estabilizado.
Configure la tabla de secuencia de instrumentos. Inyecte formate de sodio al principio de la secuencia de muestras para comprobar la calibración del instrumento. Analice primero los espacios en blanco de disolventes y preparativos, seguidos de muestras de control de calidad agrupadas para el acondicionamiento del sistema y, a continuación, la lista de muestras aleatorias.
Ejecute muestras de control de calidad a intervalos regulares, como réplicas técnicas. Ejecute dos muestras de control de calidad al final de la secuencia. Mientras se ejecuta la secuencia, compruebe la calidad de los datos, incluida la precisión de masa estándar interna y la reproducibilidad de la señal.
Para comprobar la reproducibilidad de la señal, la inspección visual de los espectros superpuestos debe ser suficiente. Se incluyeron cuatro normas internas en la solución utilizada para preparar los extractos de grano. Durante el LCMS, se observó una buena precisión de masa y una sola reproducibilidad de las normas internas para los modos de ionización positivos y negativos.
Sobre la base del análisis de los espacios en blanco, 421 señales en el modo negativo y 835 señales en el modo positivo fueron juzgadas como artefactos. Estas señales estaban presentes en espacios en blanco a intensidades iguales o superiores al 5% de la intensidad única media en las muestras de grano. Después de la eliminación de los artefactos y el filtrado posterior de los datos, el modo negativo devolvió 483 características y el modo positivo devolvió 523 características.
Aproximadamente 250 características eran biológicamente relevantes y diferían significativamente en intensidad entre las variedades de trigo. Las medidas de control de calidad, como la inclusión de espacios en blanco preparativos, estándares internos y muestras agrupadas, son importantes recordar en este protocolo.
