O metabólito é influenciado por fatores como o ambiente do genoma e as práticas de manejo. Compreender as interações entre esses fatores poderia permitir uma previsão e gerenciamento mais precisos do rendimento e qualidade de um produto. Ao incorporar uma terceira fase móvel, em vez das duas tradicionais, esta técnica permite a separação e detecção de uma gama mais ampla de metabólitos.
Metabolômica pode ser aplicada a qualquer área da biologia. Em primeiro lugar, para obter uma compreensão mais profunda da bioquímica de um organismo, e ajudar a explicar sua resposta ao estresse abiótico ou biótico em relação à fisiologia. Em segundo lugar, associar biomarcadores com a perturbação em estudo.
Como o álcool isopropílico é um solvente viscoso, deve ser introduzido a baixa taxa de sinalização, e tempo de equilíbrio suficiente usado antes de aumentar a composição para 98%Essas etapas impedirão que o sistema gráfico cromático pressione demais, devolvendo um erro ou potencialmente danificando a coluna analítica. Para começar a preparação dos grãos, use um liquidificador de laboratório para moer o grão. Execute o liquidificador em alta velocidade por 20 segundos e depois repita.
Remova o frasco do liquidificador da base. Bata na lateral do frasco do liquidificador para trazer qualquer grão grosseiramente moído para a superfície da amostra. Os grãos moídos grossresamente podem ser descartados ou armazenados.
Transfira o grão finamente moído do liquidificador para um tubo de micro centrífuga de plástico de dois mililitros. No mesmo dia da extração, prepare o solvente de extração, conforme descrito no manuscrito. Em seguida, pese 200 miligramas de grãos finamente moídos em um tubo de micro centrífuga de dois mililitros.
Adicione 500 microliters de solvente de extração ao grão no tubo. Além disso, prepare um branco adicionando 500 microliters de solvente de extração a um tubo vazio. Com um homogeneizador, fixado a 6.500 RPM, misture o solvente e o grão por 20 segundos.
Então, repita por mais 20 segundos. Em seguida, centrifugar o tubo a quatro graus Celsius e 16,100 vezes G, por cinco minutos. Transfira o supernatante para um tubo plástico de dois mililitros e mantenha a pelota.
Repita o processo de extração na pelota duas vezes. Combine os três supernantes, produzindo um volume total de extrato de aproximadamente 1,5 mililitros e misture por vórtice. Para fazer uma amostra agrupada de todos os extratos de grãos a serem usados para controle de qualidade, transfira 55 microliters de cada extrato de grão para um tubo de dois mililitros e vórtice.
Em seguida, transfira 50 alíquotas de microliter desta amostra agrupada para frascos de vidro. Transfira uma alíquota de 50 microliter de cada extrato de amostra de grão para frascos de vidro. Como descrito no manuscrito escrito, prepare as soluções que serão necessárias para espectrometria de massa cromatografia líquida.
No dia da análise LCMS, prepare 100 mililitros de 5% de acetonitrilo, contendo 200 nanogramas por enkephalina de leucina mililitro. Adicione 950 microliters desta solução ao frasco de vidro contendo a alíquota de 50 microliteres do extrato de grãos. Misture o conteúdo no frasco por vórtice.
Primeiro, configure um calibrar os instrumentos descritos no manuscrito e no guia de usuário do fabricante. Em seguida, purgar e lavar o sistema de fluidos LC usando solventes de grau LCMS, incluindo fase móvel e solventes de lavagem. Equilibre o sistema LC usando as condições de partida do método LC, garantindo que a pressão da coluna tenha estabilizado.
Configure a tabela de sequência de instrumentos. Injete formato de sódio no início da sequência amostral para verificar a calibração do instrumento. Analisar primeiro os espaços em branco solventes e preparatórios, seguidos de amostras de controle de qualidade agrupadas para condicionamento do sistema e, em seguida, a lista de amostras aleatórias.
Execute amostras de controle de qualidade em intervalos regulares, como réplicas técnicas. Execute duas amostras de controle de qualidade no final da sequência. Enquanto a sequência estiver em execução, verifique a qualidade dos dados, incluindo tanto a precisão de massa padrão interna quanto a reprodutibilidade do sinal.
Para verificar a reprodutibilidade do sinal, a inspeção visual de espectros sobrepostos deve ser suficiente. Quatro normas internas foram incluídas na solução utilizada para a elaboração dos extratos de grãos. Durante o LCMS, observou-se boa precisão em massa e reprodutibilidade única de padrões internos para os modos de ionização positiva e negativa.
Com base na análise de espaços em branco, 421 sinais no modo negativo e 835 sinais no modo positivo foram julgados como artefatos. Esses sinais estavam presentes em espaços em branco em intensidades iguais ou superiores a 5% da intensidade média única em amostras de grãos. Após a remoção dos artefatos e posterior filtragem dos dados, o modo negativo retornou 483 recursos e o modo positivo retornou 523 recursos.
Aproximadamente 250 características foram biologicamente relevantes e diferiram significativamente em intensidade entre as variedades de trigo. As medidas de controle de qualidade, como a inclusão de espaços em branco preparatórios, normas internas e amostras agrupadas, são importantes de se lembrar neste protocolo.
