Нецелевая жидкая хроматография-масс-спектрометрия на основе метаболомики Анализ зерна пшеницы

На метаболит влияют такие факторы, как геномная среда и методы управления. Понимание взаимодействия между этими факторами могло бы позволить более точно прогнозировать и управление урожайностью и качеством продукта. Путем включения третьей мобильной фазы, а не традиционных двух, этот метод позволяет разделение и обнаружение более широкого спектра метаболитов.

Метаболомика может быть применена к любой области биологии. Во-первых, добиться более глубокого понимания биохимии организма и помочь объяснить их реакцию на абиотический или биотический стресс по отношению к физиологии. Во-вторых, связать биомаркеры с изучаемым возмущением.

Поскольку изопропиловый спирт является вязким растворителем, его следует ввести при низкой скорости вспышки, а достаточное время эквилибрации используется до увеличения состава до 98%Эти шаги помешают хроматической графической системе перенапомиться, вернув ошибку или потенциально повредив аналитическую колонку. Чтобы начать подготовку зерна, используйте лабораторный блендер для измельчения зерна. Запустите блендер на высокой скорости в течение 20 секунд, а затем повторить.

Снимите банку блендера с основания. Нажмите на сторону банки блендера, чтобы вывести любое крупнозернистое зерно на поверхность образца. Крупнозернистое зерно может быть выброшено или сохранено.

Перенесите мелкозернистое зерно из блендера в двухми миллилитровую пластиковую микро центрифугу. В тот же день, что и добыча, подготовь растворитель извлечения, как описано в рукописи. Затем взвесим 200 миллиграммов мелкозернистого зерна в двухми миллилитровую микро центрифугу.

Добавьте 500 микролитров растворителя экстракции к зерну в трубке. Кроме того, подготовьте пробел, добавив 500 микролитров растворителя экстракции в пустую трубку. Используя гомогенизатор, установленный при 6500 об/мин, смешайте растворитель и зерно в течение 20 секунд.

Затем повторите еще 20 секунд. Затем центрифуга трубки при четырех градусах по Цельсию и 16, 100 раз G, в течение пяти минут. Перенесите супернатант в двухми миллилитровую пластиковую трубку и сохраните гранулы.

Повторите процесс экстракции на гранулы дважды. Объедините три супернатанта, что даст общий объем экстракта около 1,5 миллилитров и смешайте вихрем. Чтобы сделать объединили образец всех зерновых экстрактов, которые будут использоваться для контроля качества, перенесите 55 микролитров каждого экстракта зерна в двухми миллилитровую трубку и вихрь.

Затем перенесите 50 микролитров алицитов этого слитка в стеклянные флаконы. Перенесите 50-микролитерную алицита каждого экстракта образца зерна на стеклянные флаконы. Как описано в рукописи, подготовь решения, которые будут необходимы для жидкой хроматографии масс-спектрометрии.

В день анализа LCMS, подготовить 100 миллилитров 5%ацетонитрил, содержащий 200 нанограмм на миллилитр лейцин энкефалин. Добавьте 950 микролитров этого раствора в стеклянный флакон, содержащий 50 микролитров алицита экстракта зерна. Смешайте содержимое во флаконе вихрем.

Во-первых, найте калибровку инструментов, описанных в рукописи, и руководство пользователя производителя. Далее, очистить и промыть систему жидкости LC с помощью LCMS класса растворителей, в том числе мобильных фаз и мыть растворителей. Equilibrate системы LC с использованием LC метод стартовых условий, гарантируя, что давление столбца стабилизировалась.

Настройка таблицы последовательности инструментов. Ввините formate натрия в начале последовательности образца для проверки калибровки инструмента. Сначала проанализируйте растворительные и препаративные пробелы, затем объединили образцы контроля качества для системного кондиционирования, а затем рандомизированный список образцов.

Регулярно запускаем образцы контроля качества в качестве технических репликаций. Вы запустите два образца контроля качества в конце последовательности. Пока последовательность работает, проверьте качество данных, включая как внутреннюю стандартную точность массы, так и воспроизводимость сигнала.

Для проверки воспроизводимости сигнала достаточно визуального осмотра наложенных спектров. В раствор, используемый для подготовки зерновых экстрактов, были включены четыре внутренних стандарта. Во время LCMS наблюдалась хорошая точность массы и единая воспроизводимость внутренних стандартов как для положительных, так и для отрицательных режимов ионизации.

На основе анализа заготовок 421 сигнал в негативном режиме и 835 сигналов в положительном режиме были судились артефактами. Эти сигналы присутствовали в заготовки при интенсивности, равной или более 5% от средней одной интенсивности в образцах зерна. После удаления артефактов и дальнейшей фильтрации данных негативный режим вернул 483 функции и положительный режим вернул 523 функции.

Приблизительно 250 особенностей были биологически актуальными и значительно отличались по интенсивности по сортам пшеницы. Важно помнить о мерах контроля качества, таких как включение в этот протокол готовых пробелов, внутренних стандартов и унижаемых образцов.