3D tek moleküllü izleme, bireysel proteinlerin hücre altı lokalizasyonlarını ve hareket davranışlarını belirleyebilir. Bir proteinin canlı hücredeki hareketini gözlemlemek, proteinin doğal ortamında bağlayıcı ortaklarla etkileşimi hakkında önemli bilgiler sağlar. Burada sunulan yöntem, biyolojik moleküllerin difüzif durumlarını çözmek için tek moleküllü izleme verilerini analiz etmek için genel bir çerçeve sağlar.
Rasgele biçimli hücre hacimleri ile sınırlı hem 2B hem de 3B yörüngelere uygulanabilir. Floresan boncuk, ekteki metin protokolünde açıklandığı şekilde önceden hazırlanmış bir agarose pede yatırdıktan sonra, bir mikroskop kapağı nasibini yerleştirin ve kapak fişini mikroskop numune tutucusuna sabitleyin. Örnek tutucu daha sonra ters floresan mikroskobuna monte edilir.
Daha sonra mikroskobun grafik kullanıcı arabirimini başlangıç;burada, MATLAB'da özel olarak yazılmış yazılım, enstrüman kontrolü için kullanılır. Kamera yazılımı HCImage Live'ı hayata geçirin. Kamera Denetimi bölümünün altındaki Yakalama sekmesinde, pozlama süresini 0,03 saniyeye ayarlayın ve kameranın canlı yayınına başlamak için Canlı'yı tıklatın.
Lazerin engelini kaldırmak ve agarose pedüzerindeki floresan boncukları heyecanlandırmak için GUI arayüzündeki uygun Açık Lazer düğmesini tıklatın. Canlı akış modunu kullanarak kameradaki floresan emisyonunu görüntüleyin. Kullanıcı arabiriminin Mikro Konumlandırma Aşaması bölümünün altındaki XY-Position oklarını tıklatarak mikroskop aşamasının X ve Y pozisyonlarını ayarlayarak görüş alanının merkezinde en az bir floresan boncuk yerleştirin.
Gerekirse, okların altındaki açılır kutuya tıklayarak adım boyutunu değiştirin. Daha sonra Nano-Konumlandırma Aşaması bölümünün altındaki Z-Pozisyon oklarını tıklatarak mikroskop aşamasının Z konumunu ayarlayın. Floresan boncuğun çift saraklı nokta-yayılma fonksiyonunun yönünü dikey olarak ayarlayın.
Bu dikey yönlendirme Z kalibrasyonunda başlangıç noktası olarak tanımlanır. 50 nanometrelik artışlarla başlangıç Z konumunun 30 adım yukarısını ve altında tarayıp tayın. 0,03 saniyelik pozlama süresini kullanarak her adımda 10 kare kaydedin.
Otomatik veri toplamayı başlatmak için Z-Calibration altında Git'i tıklatın. Bir mililitre ısı şoku olan Yersinia enterocolitica kültürünü oda sıcaklığında üç dakika boyunca 5,000 kat yerçekiminde santrifüj edin, sonra kültürü çıkarın ve süpernatantı atın. Bir mililitre M2G ortamla peleti üç kez yıkayın.
Son durulandıktan sonra, m2G media 250 mikrolitre peletli bakterileri yeniden askıya alın. Sonraki fiducial belirteçleri olarak kullanmak için floresan boncuk ekleyin. Floresan boncuk çözeltisi, mikroskopta görüntülendiğinde görüş alanı başına sadece bir ila iki boncuk olacak şekilde eklenmelidir.
Yavaşça herhangi bir toplu hücreleri ve plaka 1.5 mikrolitre süspansiyon ayırmak için girdap tarafından karıştırın 1.5% m2G ile yapılan agarose ped üzerine, sonra ped ters ve ozon temizlenmiş mikroskop kapağı üzerine yerleştirin. Mikroskop hedefi üzerine daldırma yağı bir damla ekleyin ve mikroskop aşamasına örnek tutucu yerleştirin ve yerinde güvenli. Mikroskobun kamerasını, örnek sahnesini ve uyarma lazerlerini kontrol etmek ve ardından kamera yazılımını ortaya çıkarmak için grafik kullanıcı arabirimini başlangıç olarak verin.
Kamera Denetimi bölümünün altındaki Yakalama sekmesinde, pozlama süresini 0,025 saniyeye ayarlayın ve kameranın canlı yayınına başlamak için Canlı'yı tıklatın. Mikroskop aşamasının X ve Y pozisyonlarını, numunenin etrafında tarayıp uygun derecede yoğun bakteri hücresi popülasyonuna sahip bir görüş alanı bulmak için Mikro Konumlandırma Aşaması bölümünün altındaki XY-Position oklarını tıklatarak ayarlayın. Veri veri sini en üst düzeye çıkarmak için, kapak fişindeki hücre yoğunluğu, hücreler çakışmadan veya birbirine dokunmadan mümkün olduğunca yüksek olmalıdır.
Veri elde edilirken sahne kayması ölçülebilir, böylece görüş alanı da bir fiducial marker olarak en az bir floresan boncuk içermelidir. Daha sonra, floresan boncukların çift sarilik noktası-yayma fonksiyonu loblarının dikey olması için Nano-Positioning Stage bölümünün altındaki Z-Pozisyon oklarını tıklatarak mikroskop aşamasının Z konumunu ayarlayın. Ardından Sıra'ya gidin ve Ayarları Ton'u seçin.
Kare sayısı sayısını 20,000 olarak değiştirin. Ardından, üç noktayla etiketlenmiş düğmeye tıklayarak hedef klasörü kaydet'i seçin. Son olarak 0,025 saniyelik kısa pozlama süresini kullanarak 20.000 kamera karesine kadar toplamak için Başlat'ı tıklatın.
Bittiğinde, grafik kullanıcı arabirimindeki uygun Lazeri Kapat düğmesini tıklatarak lazer aydınlatmasını engelleyin. Ardından aynı pozlama süresini kullanarak 200 kare karanlık görüntü toplayın. Thorlabs LED yanındaki kutuyu işaretleyin ve sonra Toggle Mirror Up.This'i tıklatın ve numunenin üzerindeki LED ışığını açın ve mikroskobu floresan yolundan faz kontrast yoluna çevirin.
Faz kontrast ı sevesindeki veri toplama yazılımını başlatın ve kameradan canlı yayını görüntülemek için Canlı Ekranı Başlat/Durdur düğmesine basın. Ardından, geçerli görüş alanındaki hücrelerin faz kontrastı görüntüsünü toplamak için görüntüyü kaydetmek için Görüntü kaydet ve Kaydet'i tıklatın. Bir fiducial marker olarak kullanmak için floresan boncuk uygun.
Metin protokolünde açıklandığı gibi şablon eşeklerini kullanarak tüm yerelleştirmeleri ve tüm kamera çerçevelerini bulun ve sığdırın. Easy-DHPSF GUI'nin Yerelleştir DHPSF SM bölümü altında, tek moleküllü sinyalleri sığdırmak için Çalıştır'ı tıklatın ve ardından varsayılan ayarları korumak için aşağıdaki açılır pencerelerde Tamam'ı tıklatın. Yazılım çift sarmalı nokta-spread-fonksiyonu benzer tek moleküllü floresan sinyalleri bulacaksınız ve daha sonra bir çift Gaussian modeli kullanarak onları sığdırmak için çalışacağız.
Komut dosyası çalışırken, kullanıcı ham görüntü verilerinin bir görüntüsünün yanı sıra başarıyla takılan tek moleküllü sinyallerin yeniden oluşturulmuş görüntüsünü görür. MATLAB'da özel yazılmış yazılım kullanarak, tek moleküllü yerelleştirme verilerinde ve hücre ana hatlarında aynı beş hücrenin hücre kutuplarını kabaca tahmin ederek ve tıklatarak açılır penceredeki beş kontrol noktası çiftini el ile seçerek başlayın. 10'dan az yerelleştirme içeren hücreleri silin ve görünüm alanının dışında kısmen konumlandırılmış hücreleri kaldırın, ardından hücre anahattının içine tıklayarak açılır penceredeki diğer istenmeyen hücreleri silin.
Son olarak, bir hücrenin anahat sınırı içinde bulunan yerelleştirmeleri bu hücreye atayın. Herhangi bir hücre anahattı içinde bulunmayan tüm yerelleştirmeleri atın. Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için önemli bir faktör, tek moleküllü sinyallerin birbirinden iyi ayrılmasını sağlamaktır.
Bir hücrede aynı anda birden fazla floresan molekül varsa, yerelleştirme başka bir molekülün yörüngesine yanlış atanabilir. Bu protokol, aynı hücrede aynı anda iki veya daha fazla yerelleştirmenin bulunduğu yörüngeleri atarak bağlantı sorununu ortadan kaldırmaya çalışır. Böylece, tek moleküllü sinyaller çok yoğunsa, bu verilerin büyük bir kısmı işleme sırasında otomatik olarak atılır.
Floresan etiketli füzyon proteinlerinin ekspresyon düzeylerine bağlı olarak, hücre başına yaklaşık 200 ila 3 000 lokalizasyon oluşturulabilir. Bu yerelleştirmeler 10 ila 150 yörüngede olabilir. İyi örneklenmiş dağılımlar üretmek için çok sayıda yörünge gereklidir.
Burada gösterilen 80'e yakın belirgin difüzyon katsayıları histogram, yersinia enterocolitica Tip 3 sekresyon proteini YscQ floresan protein eYFP ile etiketlenmiş tek moleküllü yörüngeleri. YscQ, siyah renkte gösterilen dağılımda belirtildiği gibi, yaklaşık %24'ü dağılmayan moleküllerin bir kısmıyla sonuçlanan membrana gömülü enjektif enjektüre bağlanır. Kalan YscQ molekülleri sitosolda serbestçe yayılır.
Burada açıklanan yöntem sırasında, bağlı olmayan YscQ moleküllerinin en az üç farklı difüzif durumda var olduğu belirlenmiştir. Bu sonuca, bilinen difüzyon katsayıları ile simüle edilmiş dağılımların bir kütüphanesi ile belirgin difüzyon katsayıları dağılımı nın uygun olarak gerçekleştirilmesi ile ulaşıldı. Birden fazla diffüzive durumları çözmeye çalışırken, görünen difüzyon katsayısı dağılımlarının çok iyi örneklendiğinden emin olmak için binlerce tek moleküllü yörünge toplanmalıdır.
Tek moleküllü izleme yabani tip hücrelerde veya genetik deletion mutantlarda belirli diffusive durumların sadece moleküler bağlayıcı bir ortak bulunduğunda ortaya olup olmadığını belirlemek için yapılabilir. 3D tek molekül izleme kullanarak sitosolik proteinlerin ve protein komplekslerinin diffüzdurumlarını çözerek, araştırmacılar canlı hücrelerde oligomerik protein komplekslerinin nerede, ne zaman ve nasıl oluştuğunu belirleyebilirler. Yüksek güçlü lazer kaynakları ve canlı insan patojenleri ile çalışmak son derece tehlikeli olabilir.
Uygun lazer güvenlik ve biyogüvenlik protokolleri her zaman takip edilmelidir.
