Bu protokolün en önemli yararları etiketleme maliyetlerini azaltmasıdır, protein ekstraksiyonu artırır ve yüksek kaliteli veriler üretir. Protokolümüzün en önemli avantajları, farklı numune türleri için yüksek etiketleme verimliliği, bunun tekrarlanabilirliği ve güvenilir veri toplamadır. Bir IACUC onaylı protokole göre bir ötenazi fareden quadriceps kas dokusu örnekleri izole sonra, kas dokusu 10 miligram tartmak ve kas lifleri ayırmak için cımbız kullanın.
Bir lysate oluşturmak için, bir milimetre zirkon silika boncuk 200 mikrolitre ve CHAPS lysis tampon 500 mikrolitre içeren iki mililitrelik tüp içine ayrılmış doku örneği aktarın. Örnekleri bir boncuk kırıcıya yerleştirin ve iki sıralı 45 saniyelik çalışır gerçekleştirin. İkinci döngüden sonra, DNA'ya bağlı proteini serbest bırakmak için, numuneyi sonication başına 10 saniye sonicate 10 saniye buz üzerinde 30 saniyelik aralıklarla % 50 genlikte sonicate.
Son sonication sonra, lysate santrifüj ve yeni bir santrifüj tüp için supernatant aktarın. Reaktif tedavisinin azaltılması/alkillemi için, her durum için 200 mikrogram proteini yeni santrifüj tüplere aktarın ve her tüpteki son hacmi 100 mikrolitreye kadar getirmek için taze CHAPS lysis tamponunu kullanın. Daha sonra, her tüpe beş mikrolitre TCEP ekleyin ve numuneleri bir saat boyunca 55 derecede kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, 100 milimolar TEAB 132 mikrolitre iodoacetamide dokuz miligram çözünve ortaya çıkan 375 milimolar iodoacetamide çözeltisi ışıktan koruyun. Daha sonra her numuneye beş mikrolitre iodoacetamide ekleyin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Metanol/kloroform yağış için, her 100 mikrolitre proteine 400 mikrolitre metanol ekleyin ve numuneleri kısaca girdaplayın.
Numune tüplerinin kenarlarında biriken sıvıları birleştirmek için, numuneleri kısaca santrifüj edin ve her tüpe 100 mikrolitre kloroform ekleyin. Kısa bir girdap tan sonra, tüplerin yan taraflarındaki sıvıyı toplamak ve numunelere 300 mikrolitre su eklemek için tüpleri hızlı bir şekilde tekrar santrifüj edin. Girdap şiddetle homojen çözümler elde etmek ve aynı santrifüj koşulları altında bir dakika için örnekleri santrifüj.
Santrifüjün sonunda, tüpleri katmanları rahatsız etmeden bir rafa dikkatlice aktarın ve süpernatantı dikkatlice çıkarın. Kalan inter ve alt fazlara 300 mikrolitre metanol ekleyin ve numuneleri tekrar şiddetle girdaplayın. Numuneleri iki dakika santrifüj edin ve süpernatantları dikkatlice aspire edin.
Daha sonra peletler biraz nemli olana kadar bir hava akışı altında her numuneden mümkün olduğunca fazla sıvı aspire edin. Yaklaşık 10 dakika boyunca her iki dakikada bir hidrasyon değerlendirin. Gerekirse, peletler daha fazla işleme kadar eksi 80 santigrat derecede saklanabilir.
Proteini sindirmek için çökelmiş peleti 100 mikrolitre TEAB lysis tamponunda yeniden askıya alın ve 100 mikrogram tripsin cam şişesinin altına 100 mikrolitre tripsin depolama çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, her numuneye 100 mikrogram protein başına taze hazırlanmış tripsin çözeltisinin 2,5 mikrolitresini ekleyin ve numuneleri bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Peptit etiketleme için, etiket başına 41 mikrolitre susuz asetonitile her 0,8 miligram TMT etiket şişesini çözün ve etiketleri ışıktan korurken ara sıra girdaplarla reaktifleri oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, şişeleri kısaca santrifüj edin ve oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için her 100 mikrolitrelik numuneye 41 mikrolitre TMT etiket reaktifi ekleyin. Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %5 hidroksilinin sekiz mikrolitre eklenmesiyle reaksiyonları söndürün. Daha sonra eksi 80 santigrat derece depolama için yeni santrifüj tüplereşit aliquots içine örnekleri bölün.
Bu temsili veri toplamada, 39, 653 toplam peptid analiz edildi, bunların 4,457'si iki benzersiz peptide eşit veya daha fazlaydı ve 3,829'u tüm kanallar için muhabir iyonları içeriyordu. Bir kat değişimi kesme önemli ölçüde daha düşük bolluk ve 108 protein önemli ölçüde daha yüksek bolluk gözlenen 296 protein ile sağlıklı hücrelere göre hastalıklı proteinlerin göreceli dağılımını belirlemek için kullanılmıştır. PANTHER analizi, moleküler işlevlerine bağlı olarak hastalıklı hücrelerin önemli ölçüde daha düşük veya daha yüksek bolluğuna dayanan kategorilere sınıflanmış bir protein listesi gösterdi.
Önemli ölçüde daha düşük veya daha yüksek bolluk proteinlerin String analizi daha fazla etkileşimve proteinler arasında güçlü dernekler tespit. Protein-protein etkileşimlerini belirlemek, etkileşimleri gruplara göre sınıflandırmak ve çeşitli yollardaki etkileşimleri belirlemek için ek yöntemler yapılabilir. Proteomik teknikler, ayrıntılı protein bolluğu bilgileri sağlayarak hastalık gelişme mekanizmalarını anlamak için biyomedikal araştırma alanlarında ki güçlü araçlardır.
