이 프로토콜의 주요 이점은 라벨링 비용을 절감하고, 단백질 추출을 개선하며, 고품질 데이터를 생성한다는 것입니다. 당사 프로토콜의 주요 장점은 다양한 유형의 샘플, 재현성 및 신뢰할 수 있는 데이터 수집에 대한 높은 라벨링 효율성입니다. IACUC 승인 프로토콜에 따라 안락사 마우스에서 사두근 근육 조직 샘플을 격리 한 후, 무게를 10 근육 조직의 밀리그램과 근육 섬유를 분리 하는 핀셋을 사용 하 여.
lysate를 만들려면, 1 밀리미터 지르코니아 실리카 구슬의 200 마이크로 리터와 CHAPS lysis 버퍼의 500 마이크로 리터를 포함하는 2 밀리리터 튜브로 분리 된 조직 샘플을 전송합니다. 샘플을 비드 파괴기에 놓고 두 개의 순차적 45초 실행을 수행합니다. 두 번째 주기 후, DNA 결합 단백질을 방출하기 위해, 얼음에 30 초 간격으로 50 %진폭에서 초음파 당 10 초 동안 샘플을 10 시간 동안 초음파 처리합니다.
마지막 초음파 처리 후, 원심 분리 는 lysate을 원심 분리하고 새로운 원심 분리 튜브에 상체를 전송합니다. 시약 치료를 줄이거나 알키라팅하기 위해 조건당 200마이크로그램의 단백질을 새로운 원심분리기 튜브로 옮기고 신선한 CHAPS 용해 버퍼를 사용하여 각 튜브의 최종 볼륨을 최대 100 마이크로리터까지 가져옵니다. 다음으로 각 튜브에 5개의 마이크로리터를 추가하고 샘플을 섭씨 55도에서 1시간 동안 배양합니다.
인큐베이션이 끝나면 100밀리머 TEAB의 132마이크로리터에 9밀리그램의 요오도아세타미드를 용해하고 그 결과 375밀리머 요오도아세타미드 용액을 빛으로부터 보호합니다. 그런 다음 각 샘플에 5 개의 마이크로 리터를 추가하고 빛으로부터 보호 되는 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 메탄올/클로로폼 강수량의 경우, 단백질 100마이크로리터에 메탄올 400마이크로리터를 추가하고 샘플을 간략하게 소용돌이시다.
샘플 튜브의 측면에 증착된 액체를 통합하려면 샘플을 간략하게 원심분리하고 각 튜브에 100 마이크로리터의 클로로폼을 추가합니다. 짧은 소용돌이 후, 튜브의 측면에 액체를 수집하고 샘플에 물 300 마이크로 리터를 추가하기 위해 튜브를 다시 원심 분리합니다. 소용돌이는 균질한 용액을 얻고 동일한 원심 분리 조건하에서 1 분 동안 샘플을 원심분리합니다.
원심분리기의 끝에서, 층을 방해하지 않고 조심스럽게 랙에 튜브를 전송하고 신중하게 상퍼를 제거합니다. 남은 중간 및 하단 단계에 메탄올 300 마이크로리터를 추가하고 샘플을 다시 적극적으로 소용돌이시다. 샘플을 2분 동안 원심분리하고 슈퍼네티츠를 조심스럽게 흡인시합니다.
그런 다음 펠릿이 조금 촉촉할 때까지 공기 흐름 아래에서 가능한 한 많은 액체를 부드럽게 흡인합니다. 약 10분 동안 2분마다 수분을 평가합니다. 필요한 경우 펠릿은 추가 처리될 때까지 영하 80도에서 보관할 수 있습니다.
단백질을 소화하기 위해, TEAB 용해 버퍼의 100 마이크로 리터에 침전 펠릿을 다시 중단하고 100 마이크로 그램 트립신 유리 유리 유리 바이알의 바닥에 트립신 저장 솔루션100 마이크로 리터를 추가합니다. 실온에서 5분 후, 각 샘플에 100 마이크로그램의 단백질당 2.5 마이크로리터를 넣고 밤새 섭씨 37도에서 샘플을 배양합니다. 펩티드 라벨링의 경우 태그당 41마이크로리터의 무수아 아세토나이트트리어로 각 0.8 밀리그램 TMT 태그 바이알을 용인하고, 시약을 실온에서 5분간 배양하고 라벨을 빛으로부터 보호합니다.
인큐베이션이 끝나면 바이알을 잠시 원심분리하고 실온에서 1시간 배양하기 위해 각 100 마이크로리터 시약에 41마이크로리터의 TMT 라벨 시약을 조심스럽게 추가합니다. 인큐베이션이 끝나면 실온에서 15분 동안 5%의 하이드록실라민 8개 마이크로리터를 첨가하여 반응을 담금질합니다. 그런 다음 샘플을 영하 80도의 저장을 위해 새로운 원심분리기 튜브에 동일한 알리쿼트로 분할합니다.
본 대표적인 데이터 수집에서, 39, 653개의 총 펩타이드가 분석되었으며, 그 중 4, 457은 2개의 고유 펩타이드와 3, 829개 이상의 고유 펩티드보다 동일하거나 큰 3, 829개의 모든 채널에 대한 리포터 이온을 포함했다. 접이식 차단은 296단백질이 현저히 낮은 풍부와 108단백질을 관찰한 건강한 세포에 비해 병으로 인한 단백질의 상대적 분포를 결정하는 데 사용되었다. PantHER 분석은 그들의 분자 기능에 근거를 둔 병든 세포의 현저하게 더 낮거나 더 높은 풍부에 근거를 둔 단백질의 분류된 목록을 보여주었습니다.
상당히 낮거나 높은 풍부의 단백질의 문자열 분석은 단백질 사이 다중 상호 작용 및 강한 협회를 추가로 확인했습니다. 단백질 대 단백질 상호 작용을 식별하고, 그룹별 상호 작용을 분류하고, 다양한 경로에서 상호 작용을 식별하기 위해 추가 방법을 수행할 수 있습니다. Proteomics 기술은 상세한 단백질 풍부 정보를 제공함으로써 질병 발달의 메커니즘을 이해하기 위한 생물 의학 연구 분야 내의 강력한 도구입니다.
