Yazarlar DC3000 zorlanma, domates tohumu, ve tavsiye sağlamak için Dr Greg Martin (Cornell Üniversitesi) ve onun grubuna teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Dr Zhonglin yöntem geliştirme konusunda yardım almak için Biyoteknoloji Araştırma için UF Disiplinlerarası Merkezi DAB protokolü ve Proteomik Bölümü yardım için Mou teşekkür etmek istiyorum. Protein ekstraksiyonu için protokol Hurkman ve Tanaka 16 güncellenmiştir. 6 cysTMT etiketleme, adım 4 protokol orijinal Pierce Thermo Fisher Scientific ürün kılavuzuna 17 dayanmaktadır uyarlanmıştır. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (S Chen MCB 0.818.051) tarafından finanse edildi.

1. Büyüyen fidan ve hazırlanması Bakteriler <ol><li> Fideler bir büyüme oda (22 az 8 saatlik bir ışık periyodu ile 160 ľmol fotonlar m -2 s -1 MetroMix 500 toprak karışımı (BWI ​​Şirketler) içinde çimlenmiş olan 20 karanlık ° C ve 16 saatlik ° C 1 hafta boyunca. Bağıl nem oranı% 70 olarak saptanmıştır. kuru hale gelen toprak tutmak için gerektiği gibi fideler musluk suyu ile sulandı. </li><li> Benzer büyüklükteki iki fidan sonra MetroMix 500 toprak içeren 4 &quot;çap tencere nakledilen ve 1.1 aynı koşullarda ek olarak 3 hafta boyunca yetiştirilir. </li><li> Pseudomonas syringae (Pst) Kings Yatak Orta (KBM) plakaların (litre başına: 20 g proteoz Peptonlu, 0,1975 g MgSO 4,% 1 Gliserol, 1,5 g K 2 HPO 4, 18 g Agar) üzerine ilk T-çizikli ve yetiştirilen 28 az iki gün ° C. Tek bir koloni 300μl sıvı Kings karıştırılarak, toplanan B Orta (20 g proteoz pepton, 0,1975 g MgSO 4 </sub&gt;, 10 mL gliserol, 100x K 2 HPO 4 stokunun 10 ml (H 2 O 10 mL K 2 HPO 4 1,5 g), ve Kings B levha üzerine yayılmıştır. Bu 28 ° C&#39;de gece boyunca kültürlenir </li><li> Bakteriler inokulum 20 mL H 2 O. içine KBM plakadan kültüre bakteri kazıma ile hazırlanır 0,03 bir OD 600 (~ 10 6 cfu / ml), (10 mM MgCl2 + 400 uL Silwett-70) inokulasyon tamponu 1 L içinde hazırlanır. Aşılama tampon eksi bakterileri kontrol çözümü için hazırlanmıştır. </li></ol> 2. Pst ve H 2 O 2 ile Domates Aşılama Leke Histokimyasal <ol><li> Dört haftalık bitkiler 30 saniye için yukarıdaki aşılama çözüm içine batırarak ekildi. Şeffaf plastik poşet inokülasyondan hemen sonra bitkilerin üzerine konuldu. </li><li> 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidin (DAB) 11 (H2O içinde 1 mg / ml DAB, pH 3.8 (HCI)) üç d hazırlandı lekeays önce tam çözünürleştirme ulaşmak için kullanabilirsiniz. Çözelti, oda sıcaklığında karıştırarak sallandı edildi. </li><li> Yirmi dört saat tedaviden sonra, tam genişletilmiş yaprak epidermal tarafı yukarı leke DAB yerleştirilir, kaldırılır, ve vakum 15 dakika infiltre edildi. Yaprakları daha sonra boyama için gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta konuldu. </li><li> Yapraklar 10 dakika süreyle% 95 etanol içinde kaynatıldı ve sonra% 75 etanol içinde tutuldu. </li></ol> 3. Protein Ekstraksiyonu <ol><li> Hasattan sonra, domates yaprakları havanda kullanarak sıvı nitrojen ile ince toz topraklı edildi. </li><li> Doku 0.5 g, 1.25 mL fenol Tris pH 8.8 tamponlu ekleyin ve ekstraksiyon tamponu 1.25 mL / 0.5 g (0.1 M Tris-HCI pH 8.8, 10 mM EDTA, 0.9 M sukroz) daha sonra bir de birkaç dakika için devam taşlama çeker ocak. </li><li> Oakridge santrifüj tüpü (Termo Fisher Scientific Nalgene Company) ile özü aktarılır ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca ajite. </li><li> 5000 xg&#39;de santrifüjleyinve 15 ° C&#39;de 10 dakika süreyle. Yeni ve temiz bir tüpe üst fenol fazı aktarın. </li><li> Eşit hacimde Back-ayıklamak sulu faz fenol tampon ayıklanır; 30 dakika için bir çalkalayıcı kışkırtma. Santrifüj ve yeni bir Falcon tüpüne özü aktarmak. </li><li> Yukarıdaki adım bir kez daha tekrarlayın ve yeni Oakridge tüpüne özü aktarmak. </li><li> % 100 metanol (-20 ° C de muhafaza) içinde 0.1 M amonyum asetat 5 hacim ekleyerek fenol ekstre proteinleri çöktürmek. Gece boyunca -20 ° C&#39;de Vortex ve kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> 20 dakika için 20,000 xg, 4 ° C&#39;de santrifüje edilerek proteini pelet Collect. </li><li> % 80 soğuk aseton ile, metanol ve 2 kez soğuk 0.1M amonyum asetat ile pelet 2 kez yıka. Pelet için 1.5 ml soğuk% 70 etanol ekleyin ve askıya. 20 dakika süre ile, bir 2 mL mikrosantrifüj tüpü (ABD Scientific) ve 14,000 rpm&#39;de santrifüj, 4 ° C transfer. Etanol çıkarın. </li><li> Bir SpeedVac konsantratör yılında pelet kısaca kurulayın ve bir protein extr boşanmakişlem tampon, örneğin ReadyPrep Protein Ekstraksiyon Kit Reaktif 3 (8 M üre,% 4 CHAPS, 40 mM Tris-bazlı, 2 M Thiourea) (Bio-Rad). Bir pelet oluşturmak üzere 30 dakika süreyle 14.000 rpm ve 20 ° C&#39;de santrifüje. Süpernatant toplayın. </li><li> Üreticinin kılavuzu (Geno Teknolojisi) göre CB-X protein metodu kullanılarak protein konsantrasyonu ölçün. </li></ol> 4. CysTMTs ile Numune Hazırlama ve Peptid Etiketleme <ol><li> 2-5 mg / ml arasında derişimde protein numunesinin hazırlanması. Burada, her kitle etiketi için 20 ul-50 uL örneklerinin protein 100 mg kullanın. Bu deneme için tüm 6 etiketler kullanılmıştır. </li><li> Serbest tiyol grubu engellemek için protein örnek alkilasyon tampon eşit hacimde (100 mM Tris-HCI, pH7.5, 200 mM iyodoasetamid) eklenir. Tampon taze olarak hazırlanması gerekir. Alkilasyon 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de gerçekleştirilir. </li><li> Gece boyunca -20 ° C&#39;da soğuk% 80 aseton 1 ml ilave edilerek proteini çöktürmek. 14.000 santrifüj Pelet proteinrpm, 4 ° C&#39;de 20 dakika süreyle. Her vorteks% 80 aseton ile pelet 3 kez yıkayın. Süpernatantı ve buz üzerinde kuru iken yayınlamaya izin verir. </li><li> 50 uL lizis tamponu (6 M üre, 50 mM Tris baz, 1 mM EDTA) içinde pelletini. 100 mM Tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) 0,5 uL daha sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca kuluçkaya disülfid bağları azaltmak için eklenir. </li><li> Etiketleri çözünürleştirmek için reaktif tüplerinin asetonitril 20 uL ekleyerek etiketler hazırlayın. Vortex ve dibine kadar dönerler. </li><li> Bir Microcon 3KD santrifüj filtre cihazı (Millipore) kullanılarak ekstra TCEP yıkayın. Microcon 3KD sütuna 50 uL örnek ekleyin ve sütun 50 uL lizis tamponu. 10,000 xg, 4 ° C&#39;de 15 dakika süre ile santrifüje Üç kez toplam için bu adımı yineleyin. Sütun çıkarın ve temiz bir tüpe ters çevirin. 1.000 xg ve 4 ° C&#39;de 5 dakika santrifüjleyin </li><li> PH kontrol edin. Gerekirse, 1 M HCl ile 7,0-8,0 pH üzere ayarlanır. </li><li> CysTM 5 uL eklemeHer numune (cysTMT reaktif kiti 500 mikrogram protein için 20 uL etiketleri sağlar. Bu yöntemi biz etiketi beşte birini kullanabilirsiniz bu nedenle, 100 mg protein kullanır.) T reaktifi. Oda sıcaklığında 2 saat için ilerlemeye reaksiyon izin verir. </li><li> Numuneler, bir 1:1 oranında Laemmli numune tamponu (Bio-Rad) ile kombine edilmiştir. </li></ol> 5.. Sigara tepki Tag Örnek Fraksiyonu Uzaklaştırılması <ol><li> Numuneler 5 dakika kaynatıldı ve bir ön-dökme 12% poliakrilamid jel (Bio-Rad) üzerine ayrıldı. Jel süzüldü H2O ile 5 dakikalık aralıklarla üç kez yıkanır ve 1 saat için Coomassie Mavisi (Bio-Rad) ile boyanmıştır. Jel H 2 O ile birlikte bir gece de lekeli oldu </li><li> Oniki kesirler her jel şeridi toplanmıştır. Kesirler, protein grubu konsantrasyonları tayin edildi. Fraksiyonlar 1mm parçalar halinde kıyılmış ve 1.5 mL tüp içine toplanmıştır. </li><li> Jel adet 2 H,% 50 asetonitril ve 0.1 M amonyum bikarbonat ile de-lekeli idi </alt&gt; O. Mavi renk jel parçaları (~ 3-4 kez, 15 dakika her zaman) kaldırılıncaya kadar bu adımı tekrar edilmelidir. </li><li> De-lekeli jel adet 15 süpernatan kaldırılır dak, ve bir SpeedVac kullanılarak kurutulur parçaları için,% 100 asetonitril (jel parçaları kapsar) kullanılarak kurutulmuştur. </li><li> 25 mM amonyum bikarbonat aynı hacimde (as toplanmış etiketli örnek) oran: 1:10 tripsin (Promega) (protein tripsin) eritin. Örneğin, 500 ul&#39;lik bir hacimde 600 ug protein Örnek 25 mM amonyum bikarbonat, 500 uL içinde çözülmüş 60 mg tripsin ihtiyacı vardır. </li><li> Jel parçalara tripsin çözüm ekleyin ve rehidratasyonu için buz üzerinde ayarlayın. Adet kapalı değilse 50 mM amonyum bikarbonat tampon ekleyin. Rehidrasyon sonra, 12-16 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> İnkübe örneklerden sıvı protein ekstresi çıkarın. </li><li> Reaksiyon durdur ve% 5 formik asit,% 50 asetonitril ile jel parçaları kaplayarak kalan herhangi bir protein özeti kaldırmak .. Oda te de 20 dakika boyunca sallayın jel parçamperature. 5.7 ayıklanan protein örnek tüpleri süpernatant aktarın. Iki kez çıkarma işlemi tekrarlayın. SpeedVac kullanarak ayıklanan peptidler kurulayın. </li></ol> 6. CysTMT Etiketli-peptidlerin Numune Zenginleştirme <ol><li> Bir 50% bulamaç için 0.5 mL tüplere anti-TMT reçine bir gradyan ekleyin. (Gradient fraksiyonlama jel bant konsantrasyonu belirlendi. Bir fraksiyon toplama karanlık bir grup oluşur, daha fazla reçine gereklidir. Az protein olduğu gibi zayıf bantları Kesirleri az reçine gerektirir.) </li><li> Reçine daha sonra 1 x biri sütun hacmi ile üç kez yıkanır Tris tamponlu tuz (TBS) (25 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH 7.2) (Termo Scientific Pierce Protein Research Products). </li><li> Her numune için 200 ul 1xTBS ekleyin. Numuneler daha sonra, anti-TMT reçinesi (Termo Scientific Pierce Protein Research Products) ilave edildi ve 4 ° C de bir gece boyunca sallanan ardından 2 saat boyunca oda sıcaklığında çalkalanır </li><li> Sütun (için örnek ekleRMO Bilimsel Pierce Protein Araştırma Ürünleri). </li><li> 1x 200 ul TBS ile her sütunun üç kez yıkayın. Bu, daha sonra% 0.05 CHAPS (1x TBS içinde çözülmüş) ile üç kez yıkama ile takip eder. </li><li> Sütun sonra TBS 1x 4 M üre ile üç kez yıkanır. H2O iki yüz mikrolitre sonra sütun üç kez yıkamak için kullanılır. </li><li> Her bir numune, 200 uL% 50 elüsyon tamponuyla (% 50 asetonitril,% 0,4 TFA) ile üç kez yıkandı edilir. </li><li> Numuneler daha sonra, bir yoğunlaştırıcı vakum içinde kurutulur. </li></ol> 7. Kütle Spektrometresi Analizi <ol><li> % 0.1 formik asit ile% 3 asetonitril 12 uL içinde tekrar süspansiyon örnekleri ve bir Eksigent NanoLC-1B, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi, kolon (AB Sciex, USA) üzerine direkt olarak enjekte 5 ul. </li><li> Peptitler bir Proteopep II C18 kolonu 75 mikron kimliği ayrılacak bir 4-60% eğim (A kullanarak x 20 cm (Yeni Amaç, ABD):% 3 asetonitril,% 0.1 formik asit, B:% 97 asetonitril,% 0.1 formik asit)3 azından uL / ​​60 dakika zarfında dak. </li><li> Bir Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL kütle spektrometresi tek aşamalı MS oluşan x 3 deney 3 MS tarafından takip yüksek enerji C-trap dissosiyasyon (HCD) parçalanması ile MS / MS spektrumları 3 edinimi ardından bir üst 2 ile peptitler algılamak için kullanılan Protein tespiti için çarpışma kaynaklı dissosiyasyon (CID) ile / MS. Bu modda parametreleri: İzolasyon genişliği: 3,0 m / z; Çarpışma enerji:% 50 (iki aşamalı olarak% 10). Sadece iki kat-ı üç kat ücret ve peptidler parçalanması için seçildi. Dinamik dışlama parametreler belirlendi: = 1 saymak tekrarlayın; Tekrar Süre = 60; Bırakma listesi size = 500; Dışlama süresi = 28. Aşağıdaki gibi hedef değer vardır: MS = 5 e 5; MS / MS (HCD) = 1 e 5. İyon transferi kez MS / MS (HCD) için FTMS ve 300 için 500 ile belirlenmiştir. İki microscans HCD spektrumları için gerekli edildi. </li></ol> 8. Veritabanı Arama ve Miktar <ol><li> Kazanılmış CID ve HCD veriler vardıoranını ölçmek için bir Reporter Ion Quantizer (fragman iyonların 20 ppm kütle toleransı) uygulanan bir dallı iş akışı aracılığıyla Thermo Scientific Proteom Discoverer yazılımı 1.2 (Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri) kullanarak nalyzed. Ayrı bir bölüm Spectrum Seçici, Spektrum Normalizer ve Spektrum Orfoz düğümleri arasında MS 2. spektrumları işlenmiş. </li><li> Veriler daha sonra SEQUEST arama motoru karşı arandı. A 20 ppm kitle hoşgörü kullanılmıştır. Statik değişiklikler cysTMT reaktifi olarak (304,18 Da) ve dinamik değişiklikler fosforilasyon ve metionin oksidasyon (15.99 Da) dahil edildi. Solanum lycopersicum için özel bir veritabanı RNA veri (Harvard Üniversitesi&#39;nde yaklaşık 350.000 girdileri ile) 13 her iki durumda da kullanılan kullanarak bestelendi. </li></ol> 9. Temsilcisi Sonuçlar Bir kontrol domates bitkisi yaprak ve Pseudomonas inoküle yaprak temsilcisi görüntüŞekil 1&#39;de gösterilmiştir. Uygulanan kontrol ve Pseudomonas tedavi yaprakları arasında bir farklılık gözlenmiştir. Yapraklar çıkarılır ve de-boyama işlemi yaprak dokusunda ROS belirtileri (Şekil 2) göstermek için histokimyasal sağlar. DAB, kullanılarak boyandı sonra Şekil 2A boyanma bir kontrol yaprak temsilcisidir. Şekil 2B temsilcisi H 2 O 2 üretimi için Pseudomonas ve boyanma ile tedavi edilen bir yaprak. Bir redoks farklı şekilde düzenlenmiş protein Proteome Discover verilerin çıkış için bir örnek Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Bu protein bilinen bir redoks düzenlenmiş protein ferrodoksin-1 14 ve Pseudomonas syringae pv domates 15 karşı savunmada rol oynadığı gösterilmiştir. Kontrol ve aşılanmış örnekleri arasında pik yoğunluk ferredox önemli değişiklikler gösterdi Göreceli ölçüm, elde etmek için kullanılırin-1 redoks regülasyonu (p &lt;0.05). Yüksek yoğunluklu zirveleri bu proteinin patojen tedaviye yanıt olarak okside olduğunu göstermiştir. Şekil 4, bir kontrol ve aşılanmış örnek arasındaki bir proteinin benzer redoks düzenlemesi olan bir proteini Proteome Discover veri çıkışı bir örnektir. Benzer yoğunluk Peaks tedavisinde bir değişiklik ile düzenlenmeyen disülfit bağlarını varlığını düşündürmektedir. Yöntem bilim adamları redoks duyarlı sistein ve disülfitler 10 algılamak nasıl devrim olacaktır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig1.jpg" /> Şekil 1. Inoküle domates temsili bir görüntü kontrol çözeltisi (A) ve Pseudomonas (B) ile ayrılır. &lt;span class = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig2.jpg" /> Şekil 2. Aşılanmış domates DAB boyama temsilcisi görüntü kontrolü çözümü (A) ve Pseudomonas (B) bırakır. Yapraklar 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidin kullanılarak boyanmıştır. Klorofil% 95 etanol içinde kaynatılarak yapraklar çıkarıldı. Koyu boyama H 2 O 2 varlığını gösterir. Sadece bakteri kültürü koyu boyanma gösterdi inokule bırakır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig3.jpg" /> Şekil 3. Ferrodoksin-1 Proteome Discover veri çıkışı, farklı şekilde düzenlenmiş redoks proteini 14 bir örneği. Her bir tepe Yukarıda tepe yoğunluğu mutlak nicelendirilmek üzere kullanılır. Kontrol ve aşılanmış örnekleri arasında pik yoğunluk kullanılırGöreceli ölçüm gerçekleştirmek için. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3766/3766fig4.jpg" /> Şekil 4. Bir kontrol ve inoküle örnek arasındaki benzer tepe yoğunluğu olan bir proteinin Proteom Discover veri çıkışı bir örnek. Benzer yoğunluk Peaks tedavisinde bir değişiklik ile düzenlenmeyen disülfit bağlarını varlığını düşündürmektedir.

<ol>
	<li>Almeida, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+genome+sequence+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+T1+reveals+a+type+III+effector+repertoire+significantly+divergent+from+that+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 52-62 (2009).</li><li>Preiter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+virulence+gene+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+strain+DC3000.">Novel virulence gene of Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000.</a> J. Bacteriol. 187, 7805-7814 (2005).</li><li>Apostol, I., Heinstein, P. F., Low, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+stimulation+of+an+oxidative+burst+during+elicitation+of+cultured+plant+cells:+role+in+defense+and+signal+transduction.">Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells: role in defense and signal transduction.</a> Plant Physiol. 90, 109-116 (1989).</li><li>Orozco-Cardenas, M., Ryan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+is+generated+systemically+in+plant+leaves+by+wounding+and+systemin+via+the+octadecanoid+pathway.">Hydrogen peroxide is generated systemically in plant leaves by wounding and systemin via the octadecanoid pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6553-6557 (1999).</li><li>Tonks, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+redux:+revisiting+PTPs+and+the+control+of+cell+signaling.">Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling.</a> Cell. 121, 667-670 (2005).</li><li>Alvarez, S., Wilson, G. H., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+disulfide-bonded+proteins+in+Arabidopsis.">Determination of in vivo disulfide-bonded proteins in Arabidopsis.</a> J. Chromatogr. B. 877, 101-104 (2009).</li><li>Apel, K., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species:+metabolism,+oxidative+stress,+and+signal+transduction.">Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 55, 373-399 (2004).</li><li>Dayon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+quantification+of+proteins+in+human+cerebrospinal+fluids+by+MS/MS+using+6-+plex+isobaric+tags.">Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6- plex isobaric tags.</a> Anal. Chem. 80, 2921-2931 (2008).</li><li>Thompson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+a+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS.">Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Anal. Chem. 75, 1895-1904 (2003).</li><li>Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cysteine-reactive+tandem+mass+tag+reagent+for+subproteome+labeling,+enrichment+and+quantitation.">A novel cysteine-reactive tandem mass tag reagent for subproteome labeling, enrichment and quantitation.</a> , TP169 (2010).</li><li>Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+Arabidopsis+mutants:+diaminobenzidine+stain+for+hydrogen+peroxide.">Phenotypic analysis of Arabidopsis mutants: diaminobenzidine stain for hydrogen peroxide.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).</li><li>Sethuraman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope-Coded+affinity+tag+(ICAT)+approach+to+redox+proteomics:+identification+and+quantification+of+oxidant-sensitive+cysteine+thiols+in+complex+protein+mixtures.">Isotope-Coded affinity tag (ICAT) approach to redox proteomics: identification and quantification of oxidant-sensitive cysteine thiols in complex protein mixtures.</a> J. Proteome Res. 3, 1228-1233 (2004).</li><li>Asso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+and+redox+characterization+of+ferredoxins+I+and+II+from+Desulfovibrio+vulgaris+Miyazaki.">EPR and redox characterization of ferredoxins I and II from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 211, 198-204 (1995).</li><li>Huang, H. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+resistance+to+bacterial+pathogens+affected+by+the+amount+of+ferredoxin-I+proteins+in+plants.">Disease resistance to bacterial pathogens affected by the amount of ferredoxin-I proteins in plants.</a> Mol. Plant Pathol. 8, 129-137 (2007).</li><li>Hurkman, W., Tanaka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+plant+membrane+proteins+for+analysis+by+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis.</a> Plant Physiol. 81, 802-806 (1986).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol DAB boyama yapılması hakkında bilgilerin yanı sıra cysTMT etiketli redoks sistein miktar sağlar. Bu prosedürler ROS üretiminin yanı sıra Solanum lycopersicum Pseudomonas syringae ile inokule edilir protein yönetmelik üzerindeki etkisini incelerken yararlıdır. Bu protokol sunulan yöntemler yaprak dokusu hasarı en az neden olan bir şekilde bütün yaprak örneklerinde ROS incelemek için bir yol sağlar. Etiketleme prosedürü bir sistein etiketleme yöntemi kullanarak potansiyel redoks düzenlenir proteinler incelemek için bir yol sağlar. Stres yanıtı erken bir aşamada incelerken bu faydalıdır. Böyle izotop kodlanmış afinite etiket (ICAT) ve cysTMT gibi yöntemlerle biyolojik örneklerde redoks potansiyeli regüle proteinleri inceleyerek kullanılabilir. ICAT etiketleme ve iki örnek 12 karşılaştırılmasına olanak sağlar. Her iki yöntem de serbest sisteinlerin ve etiketlemek quantific protein için kullanılabilirleration 10,12. Bununla birlikte, cysTMT yöntem, bir deney varyasyonu azalma yanı sıra 10 multiplekslemesi sağlar. Kullanılabilir etiketlerin sayısı araştırmacıların deney tasarımı çoğaltır veya birden fazla numune eklemenize olanak verir. Daha örnekleri sahip tespit proteinleri ile daha fazla sayıda potansiyel sağlar. CysTMT tekniğin büyük bir dezavantajı çünkü cysTMT etiketli-peptidler (6,5-6,6) için selektif zenginleştirme basamakları proteinin tanımlanması genel kalitesini düşürüyor olmasıdır. Protein tanımlanması için peptidlerin numarası protein dizisi içinde sistein kalıntıların sayıda büyük ölçüde değişir. Bu sorun, kütle spektrometresi proteinin tanımlanması için zenginleştirme önce triptik örnek parçası göndererek aşılabilir. Deney tasarımı gibi cysTMT yöntemi kullanan bir etiketleme mekanizmasının yapısı nedeniyle, belli bir adım kritik önem taşır. Protein preci gerçekleştirirkenpitation ve pelet yıkamalar (3.9) protein yıkımı azaltmak için buz üzerinde soğutulmuş örnekleri tutmak için önemlidir. Örnekleri ters etiketlenmesi tabi olabilir, çünkü cysTMT etiketleme sırasında, indirgeyici tepkin madde (4,6) çıkarılması önemlidir. Reaktif azaltılması örnek kalırsa ters etiketleme mümkündür. Örnekleri işaretlendikten sonra azaltılmış ise, cysTMT etiketi kaldırılabilir. Etiket örnekleri eklenir sonra, pH seviyesini optimum etiketleme verim için (4.7) kontrol edilmelidir. Buna ek olarak, veri analizi araştırmacı protokolü kullanılarak içinde nihai hedefi gerekenden bağlıdır. Ayrıca her yazılım farklı algoritmalar var olarak kullanılan yazılım bağlıdır. Bu deney, domates reaktif türün oksidatif üretimi için geliştirilmiş bir elisitör olarak patojen kullanan, ancak, başka bir redoks düzenlenmiş yanıtları buna göre ölçülebilir. Bu deney tasarımı diğer bitki ve hayvan sistemlerinde uygulanabilir. </p&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> MetroMix 500 </td><td> BWI Şirketler </td><td> TX-500 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-diaminobenzidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8001 </td></tr><tr><td> ReadyPrep Sıralı Ekstraksiyon kiti Reaktif 3 </td><td> Bio-Rad </td><td> 163-2104 </td></tr><tr><td> CB-X protein tayini </td><td> Geno Teknoloji </td><td> 786-12x </td></tr><tr><td> cysTMT reaktifler </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri </td><td> 90071 </td></tr><tr><td> Laemmli Örnek Tampon </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Biyo-Güvenli Comassie (G-250 leke) </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> Microcon 3KD sütun </td><td> Millipore </td><td> 42403 </td></tr><tr><td> İmmobilize Anti-TMT reçine </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri </td><td> 90076 </td></tr><tr><td> Santrifüj sütun </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri </td><td> 89896 </td></tr><tr><td> Proteopep II C18 kolon </td><td> Yeni Hedef </td><td> PFC7515-PP2-10 </td></tr><tr><td> NanoLC-1D HPLC </td><td> AB Sciex </td><td> 90389 </td></tr><tr><td> LTQ Orbitrap XL </td><td> Thermo Scientific </td><td> 0020137580 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> Labconco </td><td> 7812013 </td></tr><tr><td> Proteom Discoverer 1.2 yazılımı </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Promega </td><td> V5111 </td></tr><tr><td> Oakridge Santrifüj Tüpü </td><td> Thermo Scientific Nalgene Şirketi </td><td> 3139-0050 </td></tr><tr><td> Microcentrifuge tüp (2 ml) </td><td> ABD Bilimsel </td><td> 1620-2700 </td></tr><tr><td> % 12 Mini-Protean TGX Prefabrik Jel </td><td> Bio-Rad </td><td> 456-1043 </td></tr><tr><td> Form Başı Formu&gt; Bio-Güvenli Coomassie StainBottom </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td></tr><tr><td> TMT zenginleştirme kiti </td><td> Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri </td><td> 90077 </td></tr></tbody></table>

profiling thiol redox proteome using isotope tagging mass spectrometry

Pseudomonas syringae pv. Domates suşu DC3000 Arabidopsis thaliana, genetik olarak çözülebilir bir ev sahibi bitki üzerindeki 1,2 Solanum lycopersicum değil, aynı zamanda Brassica türleri üzerinde bakteriyel leke hastalığa neden olmaktadır, yanı sıra, sadece. DC3000 ile aşılanmış kotiledonlarında reaktif oksijen türlerinin (ROS) birikimi 3 domates bakteriyel benek hastalığı sırasında modüle nekrotik hücre ölümü ROS bir rolü olduğunu gösterir. Hidrojen peroksit, ROS bir bileşeni, Pseudomonas 3 olan domates bitkilerinde inokulasyonunun sonra elde edilir. Hidrojen peroksit, bir histokimyasal 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidin (DAB) 4 kullanılarak tespit edilebilir. DAB boyama yaprak lekesi 4 kahverengi bir üretmek için hidrojen peroksit ile reaksiyona girer. ROS 5 bazı proteinlerin redoks durumunu değiştirebilirsiniz hücresel redoks çevre, bir düzenleyici rolü vardır. Sistein duyarlı önemli bir amino asitredoks değişir. Hafif oksidasyon altında, sistein sülfhidril grupları ile tersine çevrilebilir oksidasyon fizyolojik süreçlerin 6,7 çeşitli regüle redoks sensörler ve sinyal dönüştürücüler olarak hizmet eder. Tandem kütle etiketi (TMT) reaktifler eşzamanlı tanımlanmasını mümkün kılacak ve tandem kütle spektrometresi 8,9 kullanarak farklı örneklerdeki proteinlerin kantitatif çoğaltılmış. Sistein-reaktif TMT (cysTMT) reaktifler seçici etiketleme ve relatif sistein içeren altı biyolojik örnekler kadar, peptidleri sağlar. Her izobarik cysTMT etiketi aynı nominal üst kütleye sahiptir ve bir sülfhidril-reaktif grup, a-MS nötr ayırıcı kolu ve MS / MS reporter 10 oluşmaktadır. Etiketleme sonra, örnekler proteaz sindirime tabi tutuldu. Sistein-etiketli anti-peptidler TMT antikoru içeren bir reçine ile zenginleştirilmiş edildi. MS / MS analizi sırasında, muhabir iyonları bir dizi (yani, 126-131 Da) relatif hakkında bilgi veren, düşük kütleli bölgede ortaya çıkmaktadır.Iş akışı, örnek karmaşıklığı azaltarak dinamik aralık geliştirme ve sistein değişiklikleri incelemek için etkilidir. Burada Pst DC3000 tedavi domates redoks proteomik analizi sunmak (Rio Grande) cysTMT teknolojisini kullanarak bırakır. Bu yüksek verim yöntemi diğer redoks-düzenleyici fizyolojik süreçleri inceleyerek uygulanacak potansiyeline sahiptir.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry at JoVE.com

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Hücreleri stres koşullarına karşılaştığınızda Reaktif oksijen türlerinin seviyesi yükselir. Burada, 3&#39;-3 &#39;diaminobenzidin lekelenmesi örneğin yanı sıra redoks proteom profil cysTMT etiketleme ve kütle spektrometrisi göstermek<em&gt; Pseudomonas syringae</em&gt; Domates yaprakları tedavi.

İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

profiling-thiol-redox-proteome-using-isotope-tagging-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Görüntüleme.  University of Florida. Hücreleri stres koşullarına karşılaştığınızda Reaktif oksijen türlerinin seviyesi yükselir. Burada, 3'-3 'diaminobenzidin lekelenmesi örneğin yanı sıra redoks proteom profil cysTMT etiketleme ve kütle spektrometrisi göstermek Pseudomonas syringae Domates yaprakları tedavi.

Video: Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biyoloji

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

Nicel Değerlendirme Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi kullanarak Maya Lipidome

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp)

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Doğrudan Atmosferik Basınç Kütle Spektrometresi Tek Hücre Analizi

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- L</subYakalama Bileşik Kütle Spektrometresi (CCMS)> homosistein bağlayıcı Proteinler

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak MyoD interaktom belirlenmesi kütle spektrometresi ile birleştiğinde

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...