PO1 HL55798 (KL) ve Amerikan Kalp Derneği Scientist Kalkınma Hibe 0525532U (EG): Bu çalışma Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

1. Fare aorta izolasyonu Prosedürü Kurumsal IACUC komite onayı fare ile çalışmak gereklidir. <ol><li> Heparinzed PBS heparin sodyum 1000 adet 50 ml PBS ve karıştırmak için tersini tüp ekleyerek hazırlayın. Kan ve tahsil edilecek her aort PBS içeren bir toplama tüpü boş bir toplama tüpü hazırlayın. Tüm tüpler buz tutun. </li><li> Heparinize çizim kan (1000 U / ml Heparin sodyum 0.1ml) için bir şırınga, cerrahi aletler (iki çift kavisli bir forseps, diseksiyon makas bir çift ve bir çift microshears) ve diseksiyon için bir diseksiyon sahne hazırlar. </li><li> NIH ve kemirgen ötenazi ile ilgili kurumsal IACUC komite politikalar izleyerek onaylanmış bir odasında karbon dioksit kullanarak bir fare Euthanize. Diseksiyon aşamasına fare aktarmadan önce etkinliği için kontrol edin. </li><li> Kısaca,% 70 etanol ile fare ıslatın ve diseksiyon aşamasına fare sıkın. Kalp ponksiyonu ile fare kan çizin. </li><li> Karın ve göğüs boşluklarında açın. 25 g bir iğne ile 10 ml enjektör kullanılarak, tamamen PBS tamamen, kalp ponksiyon tarafından damarlarının kan kaldırmak için% 2 heparin içeren damarsal serpmek. Aort dokular içinde hiç kan olduğundan emin olun. Perfüzyon damar duvarındaki tüm plaklar sağlam kalmasını sağlamak için küçük bir basınç ile yavaş yavaş yapılmalıdır. </li><li> Visseral organlar, genitoüriner organlar, diyafram ve dalak, böbrekler, kalp, aort zedelemeden inceleyin ve çıkarın. </li><li> Dikkatle aort ve adventisya zedelemeden, adipoz doku ve para-aortik lenf nodlarının disseke aorta uzak. Arkus aorta dahil olmak üzere tüm aorta toplayın artan, göğüs ve karın kısımları azalan. PBS ile bir toplama tüpüne izole aort yerleştirin. Izolasyon prosedürü sırasında, geminin nemli tutmaya çalışın. </li></ol> 2. Tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması <ol><li> 1X Aort Ayrılma Enzim stok Çözümü (ADES) (125 U / ml kollajenaz tip XI, 60 U / ml Hyaluronidase tip 1-s, 60 U / ml DNaz I, 450 U / ml kollajenaz tip I, 2.5 ml PBS, Galkina ark güncellenmiştir 7). Tüm enzimler Sigma-Aldrich. Buz üzerinde stok enzim çözeltisi koyun. </li><li> PBS aort içeren toplama tüpünden çıkarın. Her aort 1X ADES 2.5 ml ekleyin. Enzimatik sindirimi kolaylaştırmak veya tüm aorta dokunmadığınızdan aorta küçük parçalar halinde kesin. 1 saat 37 1X enzim solüsyonu ile aorta ° C&#39;de (yavaş sallayarak isteğe bağlıdır). </li><li> 1 saat inkübasyondan sonra, aorta ayrı kesme ve onları 5ml polipropilen FACS tüpleri (BD Falcon), 70 mikron hücre süzgecinden geçen sindirilmiş aort tek hücre süspansiyonları hazırlamak. Pelet santrifüj hücreleri tarafından (400xg, 5 dakika, 4 ° C). </li><li> FACS tamponu (PBS,% 1 BSA ve% 0.05 NaN 3 ile desteklenmiş) 1ml hücrelerin yeniden süspanse ve tripan mavi, bir hemasitometre ve ışık mikroskobu kullanılarak aort hücre süspansiyonu kaç hücreleri belirlemek . Sindirim sonra elde edilen hücrelerin toplam sayısı fare yaş ve diyet veya ateroskleroz şiddeti bağlıdır. </li></ol> 3. Flow sitometri boyama <ol><li> Yeni FACS tüpleri uygun bir numarası etiketi. Genel olarak, akış sitometri deneyler, tek renk tüpleri, uygun floresan-eksi denetimleri (FMO) 8, uygun izotip kontrolleri ve bir dizi deney tüpleri olmayan bir lekeli bir kontrol tüpü, olmalıdır. Izole edilebilir aort lökositlerin sınırlı sayıda olduğundan, dalak lökosit tek kontrol boyama gerçekleştirmek için kullanılabilir. </li><li> Aort hücre süspansiyonları leke standart bir flow sitometri protokolünü kullanır. Kısaca, bir kısım FACS tüp (ler) içine bir aort hücre süspansiyonu 0.5-1x10 6 hücre transferi. Santrifüj yoluyla hücreler FACS tampon ve pelet 1 ml ekleyin. Şişeden pelet hücrelerden süpernatantı. </li><li> Fc blok çözüm ve antikor kokteyller, deney tüpleri, eksi bir floresan tüpler ve izotip tüpleri hazırlayın. 100μl, tüm boru ve parmak hareketiyle veya hücrelerin tekrar süspansiyon yavaşça girdap Fc FACS tampon bloğu (14.2μg/ml, klon 2.4G2) ekleyin. Örnekleri oda sıcaklığında 15-20 dakika inkübe edin. </li><li> Antikor boyama, izotipi boyama ya da FMO kontrol boyama kokteyller hazırlayın. Ön titrasyon deneylerinde antikor konsantrasyonu optimal belirleyin. Fc bloğun varlığı, numune tüpleri antikor kokteyller (100ul/0.5-1.0x10 6 hücreli) ekleyin. 20-30 dakika süreyle 4 ° C&#39;de karanlıkta. </li><li> Her tüpe 1 ml FACS tampon ekleyin, girdap santrifüj yoluyla hücrelerin karışımı, ve pelet için. Prosedürü bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Supernatant ve tekrar süspansiyon Durusu% 2 PFA 300μl pelet hücreleri. Bir akış sitometresinde örnekleri çalıştırın. <ul><li> Not: Genelde anti-CD45 antikor (yaygın lökosit antijen marker) + lökosit sonra kapı CD45 için tüm örneklerin eklenir 7 Buna ek olarak, CD45 FMO ve izotipi kontrolleri CD45 + lökosit kapısı olarak yerleştirmek için başlangıçta kullanılan olmalıdır. CD45 ifade lökosit arasında değişebilir. </li><li> Not: düşük yoğunluklu yüzey antijenlerini ifade ya da düşük olay antijenleri saptamak için, Ar-Fikoeritrin (PE) veya Allophycocyanin (APC) gibi &quot;parlak fluorochromes&quot; kullanın. Buna ek olarak, birlikte birkaç eşleştirilmiş aorta havuzu nadir olaylar tespit edilebilir; ancak, bir milyondan fazla hücre kullanılması durumunda, test başına kullanılan antikorların miktarı orantılı artmıştır edilmelidir. </li><li> Not: izole aorta minimal kan Bulaşmayı olmadığından emin olmak için ve dolayısıyla aort hücre süspansiyonu, bazı deneyler TER-119, 7 kırmızı kan hücreleri (RBC) tarafından ifade edilen bir antijen için ek boyama yapıldı . Kandaki beyaz kan hücreleri (WBC), eritrosit sayısı, yaklaşık 10x10 6 hücre / ml 8x10 3 hücre / ml. TER-119 aort örnekleri ifade dayanarak, örnek kan elde edilen beyaz kan hücrelerinin yüzdesi hesaplanır. Genelde biz aort örneklerinde% 0.02 daha az kan elde edilen WBC (Şekil 1 ) </li><li> Not: enzim tedavisi yüzey antijenlerini ifade etkileyebilir, enzim sindirimi direnç ilgi antijenler için tespit edilmelidir. Kısaca, periferik lenf nodu (PLN) veya dalak küçük parçalar 37 ° C veya enzim kokteyl olmadan 1 saat süreyle inkübe. 1 saat sonra, antijenlerin ifade flow sitometri ile belirlenir. Enzim kokteyli, birden fazla yüzey antijenleri (Şekil 2) 7 üzerinde herhangi bir etkisi vardır . Diğer bazı durumlarda, enzim tedavisi antijen ekspresyonunun önemli bir kayıp sonuçlandı. Bu sorun, alternatif hücre belirteçleri kullanarak atlatılabilmişlerdir olabilir. </li><li> Not: Canlı / ölü hücre canlılığı boyama, istenirse adım 4&#39;te sonra yapılabilir. Genellikle Live / Dead fixable Ölü Hücre Leke kiti (Invitrogen, Moleküler Problar) kullanın. Live / Dead boya hücreleri leke için, yeniden çözünmüş ölü / canlı boya karıştırmak için 1 ml PBS ve vorteks 1μl ekleyerek 1x Live / Dead çözüm oluşturmak. 1x Live / Dead boya 100-200 ul ölü / canlı tek, kokteyl, FMO ve izotip kontrol örnekleri ekleyin. Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika karanlıkta boya ile inkübe edin. Için tek bir kontrol tüpü Dead / Canlı 56 inkübe edilmelidir ° C ısı şok hücrelerini öldürmek için 10 dakika karanlık. 1 ml santrifüj yoluyla PBS ve pelet hücreleri hücrelerin yıkayın. 5. adımı protokol devam edin. </li><li> Not: Hücre içi boyama, hücre içi antijenleri ve sitokinler için bu protokol ile uyumlu. - Kısaca ilgi antijenleri bağlı olarak, hücre içi boyama eBioscience BD Pharmingen, ya da Caltag laboratuvarlar hücre sabitleme / permeabilization reaktifler kullanarak olabilir. Düzeltmek ve intraselüler boyanması için hücreler permeabilize için, ekstrasellüler boyama adım sonra (bölüm 3 adım 5), üreticinin talimatları izleyerek, tespiti / permeabilization adım gerçekleştirmek. Hücre içi yıkama adım adım 6 (bölüm 3 adım 6) protokol devam. </li></ul></li></ol> 4. Izole çevresindeki adventisya ve damar duvarında Flow sitometri analizi Lökosit flow sitometri adventisyal ve aort lökosit incelemek için aort adventisya aort duvarının içindeki aterosklerotik plakların yanı sıra göç gibi bu iki anatomik sitelerinde flow sitometri izole etmek ve gerçekleştirmek için bir protokol geliştirilmiştir. 9 Kısaca, tüm aorta önce ADES (Bölüm 2, adım 2) aort adventisya kısmen sindirilmiş ve geminin geri kalanı kaldırılır sindirilir. Adventisya kaldırıldı ve bir kenara koyun sonra geri kalanı, aort damar duvarında lökosit kurtarmak için ADES sindirilir. <ul><li> Aort adventisya İzolasyon Protokolü </li></ul><ol><li> 1X ADES (bölüm 2 Adım 1) hazırlanmasını takiben, 2.5 ml / 1X Aort adventisya sindirim enzim çözeltisi (AADES) (781,25 U kollajenaz II ve 2.5mls PBS (Worthington biyokimyasal Corp, Lakewood, NJ 14,0625 U elastaz aort hazırlamak kullanana kadar buz üzerinde)). 9 Place stok solüsyonu. </li><li> PBS aort içeren toplama tüpünden çıkarın. Her aort 1X AADES 2.5 ml ekleyin. Aorta küçük parçalar halinde kesmeyin. 10-20 dakika boyunca 37 ° 1X adventisya enzim solüsyonu ile aorta inkübe ° C </li><li> , 10-20 dakika sindirim sonra, taze PBS ile bir petri 1X AADES kısmen sindirilmiş aort dışarı aktarmak. Çok dikkatlice uzakta fr adventisyal tabakası kabuğu, iki çift kavisli bir forseps kullanarakom tek bir birim olarak aort. <ul><li> Not: Daha uzun sindirimi kolay adventisya kaldırmak için; Ancak, adventisya fazla sindirilir eğer gözyaşı olacak. </li></ul></li><li> Adventisya tamamen kaldırıldı, adventisya ve ayrı FACS tüplere aort aktarın. Adventisya tüp PBS 1ml ekleyin ve buz tüpü. Aorta tüp 2.5 ml 1X aort disosiasyon enzim çözeltisi ekleyin ve aort 40 dakika inkübe 37 ° C <ul><li> Not: enzimatik sindirimi kolaylaştırmak için, bu noktada küçük parçalar halinde aort kadar bölünmüş olabilir. </li></ul></li><li> , 40 dakika sindirim sonra, buz aorta tüp yeri ve dışında aorta ve adventisya kesme ve 5ml polipropilen FACS tüpleri (BD Falcon), 70 mikron hücre süzgecinden geçerek aort ve adventisya tek hücre süspansiyonları hazırlamak. Pelet santrifüj hücreleri tarafından (400xg, 5 dakika, 4 ° C). Bölüm 2 4. adıma dönün ve protokol devam. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Burada bütün aorta bağışıklık bileşimi, aort damar duvarı ve çevre aort adventisya analiz etmek için boyama flow sitometri gösteren rakamlar bir dizi sunuyoruz. İlk olarak, tam kan ve izole aort hücre süspansiyonu (Şekil 1) TER-119 boyanma gösteren temsili bir FACS arsa göstermektedir. TER-119 pozitif kırmızı kan hücreleri aort hücre süspansiyonları izole hücrelerinin sadece% 0,014 kan kaynaklı olduğunu gösteren aort hücre süspansiyonu, hücrelerin% 18 oluşturmaktadır. Bu sindirilir damarları açıkça gösteren önemli bir kontrol deneyi, ancak aort hücre süspansiyonu analiz lökositlerin en için periferik kan dolaşan kaynağıdır. Buna ek olarak, yöntem doğrulamak için, biz splenocyte yüzey antijenlerini aort disosiasyon enzim kokteyli (Şekil 2) etkileri değerlendirildi. Enzim kokteyli dahil olmak üzere, çeşitli antijenler CD45, CD19, CD3, TCRαβ TCRγδ ve diğer bazı yüzey antijenlerini 7 ifadesi üzerinde herhangi bir etkileri vardır. Dead / Canlı canlılığı boya ve uygun izotip kontrolleri ile birlikte CD45 boyanma tespit ve ilgi alt kapısı büyük bir nüfus ve analizi sırasında hücresel enkaz dışlamak için kullanılır. Şekil 3, canlı aort CD45 + lökosit IFN yüzdesini belirlemek için kapı vardı Υ iki genç ApoE toplanmış aorta içinde + T hücreleri - / - fareler. Şekil 3 sunulan yolluk düzeni kullanarak, bu yöntemin çok yönlülüğünü vurgulamak için, Şekil 4 iki ApoE CD68 + CD11b + makrofajlar ve IFNγ + TCRαβ + hücreler için temsili hücre içi boyama bulunan 12 - / - farelerde beslenen batı diyet hafta. / - Batı diyet beslenen ApoE beklenmektedir. Aorta, aort içinde lökosit çoğunluğu makrofajlar (40% CD68 + CD11b +) veya diğer miyeloid hücrelerin (CD11b + düşük CD68 ve CD11b + CD68-) Buna ek olarak, Th1 hücreleri TCRαβ T hücreleri (Şekil 4) infiltre aort önemli bir kısmını oluşturmaktadır. Aort lökositler ve lökosit alt kümelerini toplam yüzdesi, fare ve ateroskleroz şiddeti yaşına bağlı olarak değişir, ilgi büyük popülasyonlar için optimal yolluk strateji ampirik olarak tespit edilmelidir Flow sitometri boyama için aort adventisya izole fizibilite göstermek için, biz temsilcisi CD45 mevcut + aort ve adventisyal hücre süspansiyonları lökosit boyama (Şekil 5). Kısaca, üç yaşlı apoE - / - fare aorta sindirilir ve yukarıda açıklandığı gibi (Bölüm 2 ve 4) bir araya toplanmış. CD45 + lökosit İnfiltratif adventisya hücre süspansiyonu (% 18) ve kalan aort hücre süspansiyonu (% 11) tespit edildi. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 sindirilir aort hücre süspansiyonu TER-119 boyanmasının. Aort PBS% 2 heparin içeren kardiyak ponksiyon ile perfüze edildi. Sonra aort 37 ° C 1 saat için enzim kokteyli ile sindirilir. Aort hücreleri süspansiyon ve kan örneği (Pozitif kontrol olarak) anti-TER-119-PE Abs ile boyanmış ve flow sitometri ile analiz edildi. % 18, aorta izole bütün lökositlerin sadece% 0,014, kan kökenli lökosit olması muhtemel olduğunu belirten aort hücre süspansiyonu tüm hücreler için TER-119-pozitif kırmızı kan hücreleri hesabı. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Enzim-CD45 (üst) veya CD19 (alt) lenfositlerin ifade kokteyl tedavi etkileri vardır. </strong&gt; tedavi edilmezse (A, B) ve enzim kokteyli (C, D) ile tedavi edilen hücre süspansiyonlar LN elde edilen ve APC-Cy7-konjuge anti-CD45 ve APC-konjuge anti-CD19 mAb ile boyandı. (A, C) numaraları R1 kapısı CD45 + lökosit yüzdelerini temsil eder. (B, D) numaraları CD45 + / CD19 + lenfosit yüzdeleri temsil eder. Profiller CD45 + lökosit kapılı. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 aort lökosit analizi için Ayırıcı strateji aterosklerotik eğilimli ApoE iki aorta izole toplandı. / - Yukarıda açıklandığı gibi, fareler ve aort hücre süspansiyonları hazırlandı . Hücre süspansiyonları CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), IFNγ (eFluor 450), ve Ölü / Live Aqua boyanmış, ve BD FACS Calibur yükseltilmiş bir Cytek DXP 8 Renk kullanılarak analiz edildi. Kısaca, CD45 + lökosit kapılı (B) ve daha fazla (CF) analiz. Ölü hücreleri Dead / Canlı Aqua boyama (D) ve FSC araziler (E) dayalı analiz çıkarıldı. Canlı aort lökosit TCRαβ ve IFNγ ifade (F) incelendi. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Açıklandığı gibi aorta ve dalak - / - Şekil 4, hücre içi antijenleri ve sitokinler için intrasellüler boyama Hücre süspansiyonları bir bütün ApoE hazırlanmıştır . Aort (A) ve (B, C) dalak hücre süspansiyonları, CD11b, CD45 ve CD68 veya BD Cytofix / Cytoperm ™ Kiti (BD Biosciences) kullanarak bir izotip kontrol için boyandı. Hücreler CD45 + lökosit kapılanan ve enkaz ileri ve yan dağılım profilleri çıkarılmıştır. Intrasellüler IFNγ boyama için, aort ve dalak hücre süspansiyonları daha önce açıklandığı gibi, Golgi durdurma, PMA, ve Ionomycin C ile desteklenmiş RPMI 1640 yılında beş saat için kültüre edildi. 9 hücre süspansiyonları tek aort (D) ve dalak (E, F) Uyarılmış veya izotip (IgG1-eF450, F); sonradan CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), CD3 (APC Cy7) ile boyandı, Live Ölü Aqua ve IFNγ (E eFluor 450). T hücreleri (DF) kapılı canlı CD45 + CD3 + lökosit (CD45 + Dead / Canlı Aqua-) ve TCRαβ ve IFNγ incelenir. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig5.jpg" alt="Şekil 5"/> / - Fareler Şekil 5 izole fare aort adventisya ve aort damar duvarında Temsilcisi görüntü Temsilcisi flow sitometri karşı komplo varlığı CD45 + yaşlı ApoE adventisya ve aort duvarının T hücreleri gösterir. SSC-yan dağılım. Enkaz ve nekrotik doku otofloresans ortadan kaldırmak için, araziler FSC&gt; 750 kapılı. Kapıları da FSC &lt;3500, SSC &lt;3500 olarak belirlendi çiftlerin ek otofloresans önlemek için. Yüzdeleri kapıları CD45 + hücreler gösterir.

<ol>
	<li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-2341 (2000).</li><li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+and+inflammatory+mechanisms+of+atherosclerosis.">Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis.</a> Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).</li><li>Hansson, G. K., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+in+atherosclerosis:+a+double-edged+sword.">The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword.</a> Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).</li><li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+influx+in+atherosclerosis.">Leukocyte influx in atherosclerosis.</a> Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).</li><li>Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+atherosclerotic+plaque+cells+from+human+carotids:+a+validation+study.">Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study.</a> Cytometry. 39, 158-165 (2000).</li><li>Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+macrophage-derived+foam+cells+from+human+atherosclerotic+lesions+by+using+a+"mock"+FL3+channel+in+flow+cytometry.">Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a "mock" FL3 channel in flow cytometry.</a> Cytometry. 29, 155-164 (1997).</li><li>Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent.">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).</li><li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data.">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li><li>Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+interleukin-17A+results+in+reduced+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice.">Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.</a> Circulation. 121, 1746-1755 (2010).</li><li>Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-17+and+interferon-gamma+are+produced+concomitantly+by+human+coronary+artery-infiltrating+T+cells+and+act+synergistically+on+vascular+smooth+muscle+cells.">Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells.</a> Circulation. 119, 1424-1432 (2009).</li></ol>

Burada, fare aorta bağışıklık hücre kompozisyon, soruşturma için bir akış sitometri tabanlı bir yöntem mevcut. Bu yöntemin en büyük avantajı, tek bir hücrenin düzeyde aort bağışıklık hücrelerinin analiz etmek ve aort lökositlerin aktivasyonu durumunu karakterize etmek için yeteneğidir. Bu yöntem, fare aorta sınırlı ve (yayınlanmamış veri) ve diğerleri 10 internal meme arter, aort kapakları ve koroner arterler olarak insan örnekleri analiz etmek için bu yaklaşım değildi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzeme </td><td> Katalog Numarası </td><td> Şirket </td></tr><tr><td> Kollajenaz XI. </td><td> C7657 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> H3506 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> DNaz I, tip 2 </td><td> D4527 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Kollajenaz I </td><td> C0130 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Kollajenaz II. </td><td> LS004174 </td><td> Worthington Biyokimyasal Şirketi </td></tr><tr><td> Elastaz </td><td> LS002292 </td><td> Worthington Biyokimyasal Şirketi </td></tr></tbody></table>

flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas

Ateroskleroz, orta ve büyük boy damarların köpük hücreleri, bağışıklık hücreleri, damar endotel ve düz kas hücreleri, trombositler, ekstrasellüler matriks ve geniş nekroz ile zengin bir lipid çekirdek oluşan plakların oluşumu ile karakterizedir ve kronik inflamatuar süreç çevre dokulara fibrozis. aterosklerozun başlaması, geliştirme ve sebat 1 doğuştan gelen bağışıklık yanıtının ve adaptif silah olarak katılıyor. 2, 3 Orada önemli bir kanıt gibi makrofajlar gibi bağışıklık hücreleri, farklı alt dendritik hücreler, T ve B lenfositleri, sağlıklı ve ateroskleroz eğilimli fareleri 4 aorta içinde mevcut. Ayrıca, bağışıklık hücrelerini çevreleyen aort adventisya aterogenezde bu doku önemli bir rol öneren bulunur. 2 Bir süredir, bağışıklık hücreleri, kendi aktivasyon durumu ve aort duvarının içinde hücresel bileşimi farklı türde kantitatif tespit ateroskleroz çalışması için RT-PCR ve immünhistokimyasal yöntemler ile sınırlıdır. Birkaç denemeden insan aorta kullanılarak flow sitometri gerçekleştirmek için yapılmıştır ve böyle yüksek bir otofloresans gibi bir dizi sorunlar, 5,6 bildirilmiştir. İnsan aterosklerotik plakların kollajenaz 1 ile sindirilir ve boş hücreleri CD14 için toplanan ve boyandı + / CD11c + türevi makrofaj köpük hücreleri vurgulamak için. Bu çalışmada, bir &quot;alay&quot; kanal yanlış pozitif boyanma önlemek için kullanılır oldu. Aort örneklerinde yüksek otofloresans üretir enkaz büyük miktarda artış, sindirim işlemi sırasında biriken 6 Nekrotik malzeme vermek . Bu sorunu gidermek için, negatif ve pozitif kontroller bir panel teklif oldu, fakat bu örnekler sadece çift boyama uygulanan olabilir. Biz bağışıklık hücre kompozisyon analiz ve aktivasyon, çoğalması, bağışıklık hücrelerinin sağlıklı ve ateroskleroz eğilimli aort farklılaşma karakterize etmek için yeni bir akım sitometri tabanlı bir yöntem 7 geliştirdik. Bu yöntem, aort duvarının bağışıklık hücre kompozisyon soruşturma sağlar ve bu hastalık bağışıklık yönlerini araştırmalar için geniş bir yelpazede immünolojik yöntemler kullanmak için imkanlar açılır.

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas at JoVE.com

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Bu yazıda, aorta bağışıklık kompozisyonu araştırmak için flow sitometri tabanlı bir yöntem sunmaktadır. Kağıt aynı zamanda çevresindeki adventisya ve damar duvarında ayrı ayrı inceleyerek sağlayan ek bir teknik göstermektedir. Bu yöntem, aort lökositlerin fenotipik analizler gerçekleştirmek ve ateroskleroz çalışmalar için çeşitli immünolojik testleri uygulamak için imkanlar açılır.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

flow-cytometry-analysis-of-immune-cells-within-murine-aortas

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.3K Görüntüleme.  Eastern Virginia Medical School. Bu yazıda, aorta bağışıklık kompozisyonu araştırmak için flow sitometri tabanlı bir yöntem sunmaktadır. Kağıt aynı zamanda çevresindeki adventisya ve damar duvarında ayrı ayrı inceleyerek sağlayan ek bir teknik göstermektedir. Bu yöntem, aort lökositlerin fenotipik analizler gerçekleştirmek ve ateroskleroz çalışmalar için çeşitli immünolojik testleri uygulamak için imkanlar açılır.

Video: Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

İki-fluorochrome tarafından yedi bağışıklık hücre alt kümeleri ayrımcılık Akış Sitometresi

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are widely used as a convenient cell system for analyzing SAMHD1 activity due to a low level of SAMHD1 RNA expression, leading to undetectable endogenous protein expression. Based on similar assays developed in the Stoye laboratory to characterize other retroviral restriction factors, the Bishop lab developed a two-color restriction assay to analyze SAMHD1 in U937 cells. Murine Leukaemia Virus-like particles expressing SAMHD1, alongside YFP expressed from an IRES, are used to transduce U937 cells. Cells are then treated with phorbol myristate acetate to induce differentiation to a quiescent phenotype. Following differentiation, cells are infected with HIV-1 virus-like particles expressing a fluorescent reporter. After 48 h, cells are harvested and analyzed by flow cytometry. The proportion of HIV-infected cells in the SAMHD1-expressing population is compared to that in internal control cells lacking SAMHD1. This comparison reveals a restriction ratio. SAMHD1 expression leads to a five-fold reduction in HIV infection, corresponding to a restriction ratio of 0.2. Our recent substitution of RFP for the original GFP as the reporter gene for HIV infection has facilitated flow cytometry analysis.
This assay has been successfully used to characterize the effect of amino acid substitutions on SAMHD1 restriction by transducing with viruses encoding altered SAMHD1 proteins, derived from site-directed mutagenesis of the expression vector. For example, the catalytic site substitutions HD206-7AA show a restriction phenotype of 1, indicating a loss of restriction activity. Equally, the susceptibility of different tester viruses can be determined. The assay can be further adapted to incorporate the effect of differentiation status, metabolic status, and SAMHD1 modifiers to better understand the relationship between SAMHD1, cell metabolic state, and viral restriction.

Described here is an established method to determine the extent of HIV-1 restriction by the cellular inhibitory protein SAMHD1. Human myeloid lineage U937 cells are transduced with a SAMHD1 expression vector co-expressing YFP, differentiated and then challenged with HIV-RFP. The level of restriction is determined by flow cytometry analysis.

İnsan Miyeloid U937 Hücrelerinde Akış Sitometrisi ile SAMHD1 Kısıtlamasının Analizi

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...