Belirli nöronal popülasyonların veya beyin bölgelerinin optogenetik manipülasyonu ile, davranış serbestçe hareket eden hayvanlarda yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile değiştirilebilir. Kronik implante optik lifler ile birlikte farklı optogenetik araçlar kullanılarak, nöronal modülasyonlar ve davranışsal testler çeşitli yapılabilir. Optogenetik nihai hedefi, davranan hayvan yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile nöronal devrelerin modülasyonu.
Farmakolojik veya elektriksel manipülasyonların aksine, optogenetik nöronal devrelerde belirli hücre tiplerinin hassas bir şekilde kontrol altına alınışını sağlar. Optogenetik, davranış sırasında özel olarak tanımlanmış bölgede belirli hücre tiplerini hedeflemenin ve bu mikro devrelerde meydana gelen değişikliklerin doğrudan etkisini incelemenin mükemmel bir yoludur. Şimdi serbestçe hareket eden farelerde optogenetiği nasıl hazırlayıp, yerleştireceğimiz ve nasıl yöneteceğimiz konusunda adım atmak için bir adım atacağız.
Optik implantın hazırlanması için, bir tezgah mengeneye seramik ferrule düz tarafı yerleştirin. Bir lif sıyırma aracı ile 200 mikrometre çapında cam elyaf kodu şerit ve bir seramik elyaf katip ile 2-3 santimetre olmayan parçalar kesti. Seramik ferrule içine cam elyaf parçası yerleştirin sonra bir enjeksiyon kanül ile düz tarafında bir superglue bir damla yerleştirin.
Seramik ferrule yuvarlak tarafında, mümkün olduğunca kısa cam elyaf kesilmiş ve dört farklı yayın kağıtları yuvarlak tarafı parlatmak için bir ferrule parlatma diski ön implant yerleştirin. Daha sonra, seramik ferrule düz tarafında cam elyaf kesilmiş, implantasyon için gerekli uzunluğa. İmplantın uzunluğunu hesaplamak için fare beyin atlası kullanın.
İmplant, ilgi alanının hemen üzerinde sona ermeli. İmplantasyondan önce anestezi uygulanır. El yazmasında kesin ve estetik teknik açıklanmıştır.
Fare derin bir anestezi durumuna ulaştığında, bir ısıtma plakası üzerine yerleştirin ve stereotaktik çerçeve içinde kafa düzeltmek. Burun ve ön ve her iki tarafta kulakları dişleri düzeltin. Farenin arkasına subcuntaneously bir cuprofen ile bir algesia uygulayın ve kurutma onları korumak için her iki göz de opak göz merhemi uygulayın.
Islak bir kağıt havlu ile kafa derisi üzerinde saç nemlendirin ve sonra makas kullanarak kesti. Islık bir kağıt havlu ile tüm gevşek saç ları kaldırmaya özen güvendir İyot içeren bir tentür ile kafa derisi dezenfekte etmek için bir pamuk sopa kullanın.
Bir cızırtacı ile ilgi bölgesi hakkında kafa derisi yükseltmek ve orta hat boyunca bir santimetre kesti. İmplantasyon için kafatasını pürüzlendirmek için, yara nın üzerine az miktarda fosforik asit uygulayın ve 15 saniye boyunca etkisini gösterdi. Bir pamuk sopa ile tüm asit çıkarın ve iki kez sodyum klorür ile yara durular.
Uygun enjeksiyon için, bireysel koordinatlar için F faktörünü hesaplayın. Stereoctatic çerçeve içinde bir cam kanül yerleştirin ve bregma üzerinde doğrudan bulmak. Şimdi koordinat sistemini sıfırlayın ve cam kanülü Lambda'ya taşıyın.
Aşağıdaki formülle F faktörlerini hesaplayın. Bregma eksi Lambda 4.2 ile bölünür F faktörüne eşittir. Tam koordinatlar enjeksiyon ve implantasyon için çok önemlidir, aksi takdirde, yanlış yapı uyarılırsa o zaman davranışsal etkileri spesifik değildir.
Tüm farelerin kafatası büyüklüğünde minimum sapmaları vardır, bu nedenle katsayı kesinlikle zorunludur. İlgi alanının hemen üstündeki yara parçasının konumunu bulmak için ayarlanmış koordinatları kullanın. Yerinde kanül döndürerek, kafatası içine bir delik delmek için bir enjeksiyon kanül kullanın.
Şırıngaya bağlı cam kanülün içine bir virüs çözeltisi almak için kafatasına bir damla sodyum klorür ve üstüne bir parça pirofen yerleştirin. Pirofenüzerine iki mikrolitre lik virüs çözeltisi yerleştirin ve cam kanonun ucunu virüse indirin. Negatif basınç uygulayın ve virüs çözeltisi kanül tarafından alınana kadar bekleyin.
Kanüllü virüsün ucu kafatası seviyesinde olduğunda bu koordinata sıfır ve yavaşça sondaj kenarına kadar enjeksiyon tarafının en düşük konumuna indirin. Menisküs indirilir kadar şırınga ile pozitif basınç küçük bir miktar uygulayın. Bir sonraki konuma cam kanül yukarı taşımadan önce virüs 2-3 dakika boyunca yayıldı sağlar.
Cam kanülünü çok yavaş çıkarın ve son enjeksiyondan sonra atın. Şimdi kafatasını implantasyona hazırlayın. Basınçlı hava ile kafatası kuru, bu ilgili sopa ile astar uygulayın ve 15 saniye kuru izin.
Aynı sopa ile bağ uygulayın ve UV ışığı ile 20 saniye boyunca tedavi. İmplantı ilgili tutucuya yerleştirin ve cam elyafın ucunu doğrudan sondaj deliğinin üzerine yerleştirin ve dikkatlice indirin. Süper yapıştırıcının kalan vanası kafatasına değdiğinde implantı düşürmeyi bırakın.
Optik liflerin implantasyonu hipokampus gibi ikili yapılar için de yapılabilir. Bu aynı anda her iki hemisferde hafif stimülasyon sağlar veya iki farklı yapıların uyarılması sağlar. Virüsü optik fiber implanttan farklı bir yerde enjekte etmek de mümkündür.
Enjeksiyon ve implantasyon farklı bölgelerde yapılıyorsa, fosforik asit uygulandıktan sonra ancak iki bileşenli yapışmadan önce gerekli tüm delikleri delin. Kafatası hala tamamen kuru olup olmadığını tekrar kontrol edin, sonra implant etrafında sıvı diş çimentosu uygulamak ve çevresinde uv ışığı ile 20 saniye boyunca tedavi tamamen kürk ücretsiz ve kurutulmuş kafatası alanında iki daha az çimento uygulayın. Uv ışığı ile her katmanı tedavi edin.
Ameliyatı bitirmek için tüm yara üzerinde iyot anointment uygulayın. Burun ve kulak fiksasyon bırakın, taze bir kafes içine fare getirmek ve vücut ısı kaybını önlemek için bir ısıtma lambası altına yerleştirin. Günde en az bir kez sağlık durumunu kontrol edin ve gerekirse üç gün sonra ameliyat ve algezi sonrası olacaktır.
Kurtarma iki hafta sonra, fareler davranışdeneyleri için kullanılabilir. Pulser Yazılımını açın ve ışık kaynağının takılmış olduğu USB com bağlantı noktasını seçin. Harici bir yazılımın ışık kaynağını denetlemesine izin vermek için üç işlem modunu seçin.
Beş milisaniyelik ışık darbesi ile 20 Hertz stimülasyon için doğru ayarlamayı seçin. Darbeci ile iletişim kurmak için bölümü bulmak için başlangıç sırasına basın. Bu durum, denemeler tamamlanana kadar kalır.
Şimdi, EthoVision XT'de yeni bir deneme oluşturun, dosyaya gidin, şablondan yeni sini seçin ve önceden tanımlanmış bir şablon uygulayın'ı seçin. Canlı izleme yi seçin ve kamerayı kaynakla seçin ve bağlı Puslar Gen-Eye kamerasını onaylayın. Kaydedilmesi gereken hayvan olarak fareyi seçin.
Arena şablonu, açık alan kareve bölge şablon merkezi, kenarlık, köşeleri seçin. İzlenmesi gereken bir konuyu onaylayın ve merkez noktası, burun noktası ve kuyruk tabanını seçin. Arka plana göre hayvan renginin daha koyu olduğunu ve adımı bitirmek için önerilen örnek oranını onaylayın.
Denemeyi uygun adlayın ve kaydetmek için bir konum seçin. Arena ayarlarını bulana kadar kamera otomatik olarak arka plan görüntüsünü açar. Önceden tanımlanmış bölgeleri ok ve iki sembolü kullanarak gerçek arenaya uyarla.
Bazı bölgeler gereksizse, bunları silin. Kalibre etmek ve labirentin bir köşesinden diğerine bir çizgi koymak için çizim ölçeğine basın. Santimetre olarak gerçek mesafenin uzunluğunu girin.
Bunu diğer eksen için tekrarlayın. Deneme denetimi ayarlarını tanımlamak için koşul süresini 20 dakikaya ayarlayarak ana kuralı hazırlayın. Star Trek için koşul, konu iki saniye için arenada olduğunda, fare arenada olduğunda izleme otomatik bir durum için olmalıdır.
Işık stimülasyonu için bir alt kural oluşturmak için yapılara gidin, daha fazlasını ve alt kuralı seçin. Ana kuralın altına yerleştirin ve iki kutu yayıldı. Koşullara gidin, zaman ve bir ışık gibi bir isim vermek, durumu ayarlamak beş dakika sonra karşılanır.
Kutuyu alt kuralın başlangıç kutusunun hemen arkasına yerleştirin. Eylem özel donanım gidin ve bir ışık ile adlandırın. Gerçekleştirmek için eylem seçin:Bir yüksek koyacağım.
Kutuyu doğrudan durum kutusunun arkasına yerleştirin. Işığı üzerine doğru programlamak için adımları tekrarlayın. Şimdi yapılara gidin, alt kural başvurusu na başvurun ve başvurunun doğru alt kurala ait olup olmadığını kontrol edin.
Başlangıç koşullarını gecikmeden başlatın ve başlangıç koşulu başına bir kez çalıştırılanın koşulları başlatın. Referans kutusunu, ana kuralın iki numaralı ve koşullu kitapların bir ve koşul kitapları arasına yerleştirin. Şimdi, sisteme ne izlemesi gerektiğini göstermek için algılama ayarlarını tanımlayın.
Arenaya bir test mili yerleştirin ve otomatik kurulum seçin. Hayvan türü olarak kemirgen seçin ve arenada fareler etrafında bir kutu çizmek için fare imleci kullanın. Bakım sorusunun sonuçlarını evet ile onaylayın.
Açık alan deneyi için, uygun bir anksiyete düzeyini sağlamak için deneyden hemen önce deney fareyi davranış odasına getirin. Çift fare kafesızgara hafifçe basarak ışık kaynağının bir yarık olabilir. Işık kablosuna alışmak için 10 dakika boyunca taze çöplü bir bekleme kafesine yerleştirin.
Stop düğmesine basarak satın almaya başlayın ve XT'yi görmeniz için. Fareyi bekleme kafesinden açık alanın sol üst köşesine aktarın. Deneme sırasında farenin görsel alanını bırakın ve sakin olun. 20 dakika sonra, deneme bittiğinde, fareyi labirentten çıkarın, ışık kablosunu çıkarın ve kendi kafesine geri koyun.
Bir kontrol görselleştirmesi ile, ışık kapalı ve yüzlerde ışık arasındaki merkezi zaman farklılıkları doğrudan görülebilir. Işık açıkken fare merkezde daha az zaman geçirir. Barnes labirent deneyi için, deneyden yaklaşık bir saat önce tüm deneysel fareleri davranış odasına getirin.
Biri hariç tüm delikleri kapatarak Barnes labirent hazırlayın, ve şimdi bir kaçış kutusu yerleştirilir. Her iki implantta ışık kaynağında bir fare bağlayın ve doğrudan Barnes labirentinin ortasına yerleştirin. Başlat tuşuna basın ve bir sonraki T'yi ziyaret edip karton kutuyu kaldırmanız gerekir.
Yazılımın tüm geçişi tanımaması durumunda denemeyi el ile durdurmaya hazır olun. Fareyi labirentten çıkarın ve ışık kablosuna olan bağlantıyı çıkarın. Gerçekleştirirken, öğrenme ve bellek görevi, manipülasyon hemen etkisi değil, aynı zamanda edinme, konsolidasyon veya alma sırasında manipülasyon uzun vadeli etkisi araştırılır.
Veri analizi için, tedavi durumunu tedavi veya kontrollü bulursunuz, iç içe gidin ve deneme kontrol durumunu seçin. Element eylem Star Trek gelen durum aralığı seçin eleman eylem ışık bir gider. Yuvalama kutusunu filtre kutusu işleme sayıltıcı sıyrık ile ilgili sonuç kutusu arasına yerleştirin.
Bu tanımlı aralık birdir. Kontrol grubu için de iki ve iki aralıklarla adımları yineleyin. Ayrıca analiz profilinde analiz edilecek parametreleri tanımlayın.
Bölgede bağımlı değişkeni seçin ve bölge merkezini, gövde noktasını, merkez noktasını seçin ve deneme istatistiklerine gidin. Sıklığı, kümülatif süreyi seçin ve ilkini görelim. Ayrıca değişken olarak mesafe hareket ekleyin.
Bu profille, merkezde harcanan zamana ait veriler, merkez girişleri ve mesafe taşıması söylendi. Her bölümden veri ayıklamak için sonuçlara gidin ve istatistikleri ve grafikleri seçin, analiz edilen verileri görmek için hesapla'ya basın. Dışa aktarma verilerine basın ve deneme istatistiklerini ve kaydedilen konumu seçin.
Dışa aktarılan veriler bir excel dosyası olarak ve her fare için tek tek değerlerle kaydedilir. Ayrıca, ısı haritası görselleştirme gidin ve her fare ve deneme için bireysel ısı haritaları görmek için sağ daki çizim ısı haritaları basın. Fareye sağ tıklayın ve ısı haritalarını görüntü olarak dışa aktarın.
Daha sonra, excel dosyasını bilgisayar açın ve dört deneme ve ölçülen her klima grubu için ortalama ve standart euro SCM hesaplayın. Grafikler ve Sigma çizimoluşturmak için, Sigma arsa için ekstra dosyadan doğru sıraya anlamına gelir ve SCM kopyalayın. Satırlar kapalı bir, bir için veri içermelidir ve sütunlar deneme, ortalama ve SCM hertz içerir.
Üç sütunu da seçin ve grafikler oluşturmaya gidin. Çubuk kutusunu seçin ve ok ile gruplandırılmamış kutuyu seçin. Grafiğin tamamını etiketleyin, eve gidin, grafik kutusunu seçin ve dışa aktar'a basın.
Hedef klasörü seçin ve biçim olarak meta dosyayı seçin. Elde edilen verilerin istatistiklerini hesaplamak için, Xcel'den gelen doğru verileri bire bir ve Sigma çiziminin tek sütunlarına kopyalayın. Karşılaştırmak istediğiniz sütunları işaretleyin ve çözümlemeyi yapın, T testi'ni seçin ve çalıştır'a basın.
Son olarak, davranışsal veriler izin ve deneme ek ısı haritası uzmanlaşma ile bölünmüş gösterilebilir. Açık alan deneyinde, Channelrhodopsin2 ve piramidal nöronların ışık stimülasyonu sırasında, merkez süresi azalır, hangi artan anksiyete düzeyleri gösterir. İmmünohistokimya ile virüsün enjeksiyon yeri ve ekspresyonu belirlenebilir, ayrıca cre-bağımlı fare çizgisinin özgüllüğü de doğrulanabilir.
Bir açıkça Channelrhodopsin ışık stimülasyonu görebilirsiniz2 Bu özel korteks bölgesinin zihin nöronları geliştirmek anksiyete düzeylerini artırır, Bu stimülasyon önce temel anksiyete ile karşılaştırıldığında. Manipülasyonun davranış üzerindeki bu hemen etkisi, optogenetik bugün davranışla ilgili bu kadar çok araştırma sorusu için kullanılmasının nedenidir. Bu işlem fare beyninde istenilen herhangi bir hücre tipi veya nöronal devre Optogenetik modülasyonu için kullanılabilir.
Bu prosedürü araştırmanız için uygun davranış testleri ile birleştirerek, davranış ve ilgi hastalıkları ile ilgili nöronal devreler daha derin bir fikir elde edilebilir.
