These studies were funded by grants received from the NIH (MH082876, DA023988).

! DİKKAT: Bu protokol sınıf 3b lazer kullanımını gerektirir ve takip edilmesi uygun eğitim ve güvenlik kurallarına gerektirir. Lazerler çalıştırırken Güvenlik gözlükleri hizalama işlemleri özellikle yüksek risk gösteren ile, her zaman giyilmelidir. Belirli bir lazer için maksimum zayıflama sağlayacak gözlük belirlemek için lazer sağlayıcınıza başvurun. Varsa, bir kurumsal lazer güvenlik eğitim kursuna kayıt. Uygun güvenlik gözlük ve eğitim olmadan bir lazer kesinlikle çalıştırmayın. 1. Lazer Aparatı Set-up Uygun olduğu yerde, Bölüm 1 &#39;de adımlar sırasıyla tek veya çift lazer sistemleri arasında ayırt etmek için, (A) ya da (B) olarak belirlenmiştir. <ol><li> Takın ve breadboard lazerler sabitleyin. Breadboards mükemmel ısı iletkenler ve uzun süreli kullanım ile iç lazer bileşenlerinin zarar görmesini önlemek için bir soğutucu olarak hareket ederler. </li><li> (A) ön-birleştiğinde las Güvenlier ¼ 20 &quot;kapak vidaları ve pulları (Şekil 2A) kullanılarak 10&quot; x 12 &quot;breadboard (ya da gerektiği gibi) için. Breadboard delikleri lazer montaj delikleri ile aynı hizaya yoksa, breadboard için lazer sabitlemek için küçük &#39;masa kelepçeler kullanabilirsiniz. </li><li> 2 lazerler kullanılır Varsa (B), çok farklı ışın yükseklikleri (&gt; ~ 1 cm) sahip lazerler biri için bir platform oluşturmak için küçük 4 &quot;x 6&quot; Breadboards kullanın. Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi ana büyük 12 &quot;x 18&quot; bu panoları takın breadboard pullar ile ¼-20 &quot;kapak vidasını kullanarak, daha sonra kapak vidaları veya masa kelepçeler kullanarak küçük kurullarına lazer takın. Kapak vidaları veya bir değişken yükseklik tablo kelepçe kullanarak breadboard doğrudan diğer lazer takın. Kritik Adım: Breadboards, vidalar ve optik bileşenleri ürün satın alırken bu kadar tutarlı olması emperyal veya metrik olarak satın alınabilir; Bu protokol için varsayılan emperyal olduğunu. </li><li> (A)Coupler&#39;e kalın-ceketli düz cleave / fiziksel temas (FC / PC) yama kablosu takın (bir bağlantı kablosu olarak anılacaktır; Şekil 3) fiziksel lazer (Şekil 2A) önüne takılı olduğundan emin. </li><li> (B) daha sonra kullanım sırasında gevşemesine ve hiza önlemek için, coupler ve JB Kwik veya benzeri epoksi kullanarak yazının üstüne arasındaki ortak epoksi, ¾ &quot;optik yazı üzerine birleştirici Konu. (Breadboard delikleri her zaman optik bileşenleri, post tutucu, ayaklı taban adaptörü gerekli yerleştirme ile hizaya olmaz, ve çatal sıkma yerine birleştiriciden optik sonrası sabitlemek için kullanılan gibi) breadboard için yazı takın. Kuplöre arkasına kalın ceketli yama kablosu (bağlantı kablosu) takın. </li><li> (B) Kinematik tutucu içine mavi lazer için ilk direksiyon ayna yerleştirin ve ¾ &quot;optik yazı ile breadboard ekleyin. Bir baz ADAp Bu yazı takınter ve sıkıştırma çatal. Sıkıştırma çatal yerleştirin ve dikroik ayna doğru lazer yönlendirmek için 45 ° açılı ayna mavi lazer önünde doğrudan derleme sonrası. Bir kaba hizalama kılavuz olarak breadboard deliklerin ızgara deseni kullanın. Bir kez kabaca konumlandırılmış, (C Şekil 2B bakınız) breadboard için sıkıştırma çatalı sabitlemek için ¼ &quot;-20 kap vida kullanın. </li><li> (B) Kinematik tutucu içine dikroik ayna yerleştirin ve 1 &quot;Optik mesaja ekleyin ve breadboard doğrudan sabitleyin. Uzak bir sola dikroik ayna yerleştirin ve mavi lazer ayna, doğrultusunda. Mavi ışık ilk ayna yansıyan böyle bir 45 ° açıyla dikroik ayna coupler yansıdığı Açı, daha sonra (C Şekil 2B bakınız) yazılan kinematik tutucu takılarak vidayı sıkın. </li><li> (B) ¾ &quot;optik yazılan sarı lazer için ilk direksiyon ayna takın. OPTI takınBir baz adaptörü ve sıkma çatal cal sonrası. Sarı ışık ikinci direksiyon ayna yönelik olacak şekilde 45 ° açıyla sıkma çatal ve sarı lazer ve açı ayna önünde doğrudan sonrası topluluk yerleştirin. &quot;Bir ¼ ile -20 kapak vida ve pul yerine sıkma çatal sabitleyin. </li><li> (B) 1 &quot;Optik yazılan sarı lazer ikinci direksiyon ayna takın. Açı ilk aynadan sarı ışık huzmesi dikroik yoluyla ve kuplörün (Şekil 2C) içine yansıyacaktır ki ayna gibi. Breadboard doğrudan yazı Güvenli ve ayna uygun açılı bir kez montaj vidasını sıkın. İnce ayna ayarlamaları bir sonraki adımda kinematik ayna bağlar kullanılarak yapılacaktır. </li><li> (B) ¾ &quot;optik mesaja bir nötral yoğunluk filtresi tekerleği takın ve bir montaj tabanına bağlı bir post tutucu içine yazı yerleştirin. İlk ve se arasındaki breadboard için topluluk GüvenliTek ¼ &quot;-20 kap vida kullanarak koşul sarı aynalar. Bu tekerlek bağlayıcı ulaşan sarı lazer ışığının gücünü ayarlamak için kullanılır. İpucu: Bireysel tabanına onları takmadan önce (örneğin mesajların üstüne kinematik ayna sahipleri tutan vidaların ve mesajların altına baz adaptörleri tutan parçacıkları gibi) tüm bileşenleri sıkın. Yeterli tork için optik mesaj temin geçen delikler içinden küçük bir altıgen anahtar bir şaft kullanın. Bu bileşenler yeniden düzenlenmesi gerektiren, kullanım sırasında gevşek geliyor önleyecektir. </li><li> Breadboard FC / PC L-dirsek adaptörü bir FC / PC takın. </li><li> İsteğe bağlı: İki veya daha fazla hayvanların eş zamanlı in vivo uyarılması için breadboard doğrudan 1 x 2 50/50 Mini küp elyaf ayırıcı sabitleyin. Buna ek olarak, kolları (Şekil 2A&#39;da görüldüğü gibi) maket tertibatının hareket yardımcı olmak için ilave edilebilir. </li></ol> 2. Lazer Kaplin (Temassız Stil Kaplin) Bu bölüm, çift lazer kurulumu (Şekil 2B) ile ilgilidir. Dış sarı lazer hizalama yolu önce iç mavi lazer yolunu hizalayın. ! DİKKAT: Göz güvenliğini sağlamak için düşük ışık güç kavramayı (~ 1 mW) kullanın. Lazer ve ışık yoğunluğu ölçülür ve güvenli olarak kabul edilene kadar iktidara koruyucu gözlük takın. <ol><li> Lazerin arkasındaki anahtarları ayarlamak için &quot;Curr&quot; (güncel) ve transistör-transistör mantığı modu (TTL) + sabit aydınlatma için (Analog modunda aksine). Sürücünün önündeki güç düğmesi sıfır ayarlanmış olduğundan emin olun. İlk ve ardından sürücü lazer anahtarını çevirerek lazer açın. </li><li> Yavaş yavaş ~ 1 mW lazer ışığı yaydığı ediliyor ve böylece lazer sürücünün önünde bulunan güç düğmesini ayarlayın. 15 dakika (ya da üretici tarafından belirtilen şekilde) lazer için ısınmak için - 10 bekleyin. </li><li> Fre doğrudan fiber optik kablo test cihazı bağlayıne bağlantı yama kablosunun ucunu ve kablo test cihazı (Şekil 3A) açın. Kırmızı ışın düz geri dikroik aynanın merkezine doğru hareket böylece kuplöre açısını ayarlayın. kablo test yayılan kırmızı ışık ışın yolu gelen lazer ışığı lazer içine birleştirilebilir için takip gerekir kesin yoldur. </li><li> Bir kaba hizalama gerçekleştirin: coupler içine lazer ışığı demetini yönlendirmek için kinematik aynalarda yanal ve yatay düğmeleri kullanın. ayaklı kelepçeler biraz aynalar ve bağlayıcı yeniden konumlandırmak için gevşetti gerekebilir. kinematik bağlar daha da ince ayarlamalar için bazı seyahat olmalıdır. Hiçbir mavi ışık şu anda bağlantı bağlı yama kablosu üzerinden yayılan ediliyor ise endişe etmeyin. </li><li> Dikroik ve coupler arasında doğrudan dikroik aynanın önünde yarı-saydam bir kağıt tek parça yerleştirin. Orada olacak mavi ve ar hemsırasıyla lazer ve kablo test cihazı, bu kağıt üzerinde ed nokta. Yeterince kağıdın aynı tarafına aynı anda kırmızı ve mavi lekeler de görmek saydam kağıt kullanın. </li><li> İlk direksiyon ayna ince ayarlamalar yapın (yani, lazer, değil dikroik yakın olanı) dikkatle mavi nokta ile kırmızı nokta merkezini hizalamak için yanal ve yatay topuzlar ayarlayarak. </li><li> Birleştirici önünde doğrudan böylece kuplöre doğru geri kağıt taşı ve kırmızı ışın lazer ışını hizalamak için saniye (yani, dichroic) ayna düğmeleri ayarlamak. </li><li> (Kırmızı ve mavi ışınlar colinear kadar, yani) / mavi, sarı ve kırmızı kirişler merkezi tam her iki pozisyonda hizaya kadar 2.6 ve 2.7 adımları üzerinde yineleme. </li><li> Bağlantı kablosu Kablo test cihazı çıkarın. Lazer ışığı artık bağlantı yama kablosu ucundan yayılan edilmelidir. </li><li> DetermiBir güç ölçer kullanarak bağlantı yama kablosu fiber ucundan yayılan ışık gücü ölçerek ne bağlanma verimliliği. Güç ölçerin fotodiyot 500 mW ayarını kullanın ve kullanılan mavi (473 nm) veya lazer bağlı sarı (635 nm) spektrum ışık dalga boyu ayarını (λ) değiştirebilirsiniz. </li><li> Bir güç okuma elde etmek için fotodiyot dik lif ucu yerleştirin. Fiber ucundan yayılan ışık güç birleştirici giren ışık gücü karşılaştırın. &gt;% 80 bir bağlanma verimliliği çok iyi olarak kabul edilir. İkinci direksiyon ayna Çok küçük daha ayarlamalar bazen biraz bağlantıyı artırabilir. Genel olarak, birleştirme lif ucundan ışın desen lif çekirdek içine verimliliği bağlanması (çevreleyen hiçbir halkaları ile), küçük, dar, merkezi nokta, olduğu zaman en uygunudur. </li><li> Tekrarlayın 2.1 adımları - Sarı lazer için iki direksiyon aynalar dışında, sarı lazer bağlantısı için 2.11 (Şekil 2C bakınız). Yapılacak hiçbirt dikroik ayna veya mavi lazer hizalama pozisyonu kaybolur ayarlayın. </li></ol> 3. in vivo optogenetic Uyarım Hayvan kullanımını içeren herhangi prosedürler ilgili Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından yerel ve ulusal kurallara göre yapılan ve onaylanan emin olun. <ol><li> Optik elyaf kurulumu (yama Farklı kablo tiplerindeki tanımlanması için Şekil 3B bakınız aşağıdaki adlandırılır). Tek bir fare teşvik doğrudan breadboard bağlı YP / YP L-dirsek adaptörü kullanarak kalın ceketli yama kablosu bağlantı yama kablosunu bağlamak için (Şekil 4A). , Bir lazer iki hayvan teşvik 1 x 2 50/50 Mini küp kullanarak iki kalın ceketli yama kablolara bağlantı yama kablosunu bağlamak için (Şekil 4B bakınız). 1 x 2 m kullanarak modlu fiber splitter bağlantı kablosunu takmak, üç veya daha fazla hayvan teşvik etmekini küp zaten breadboard bağlı (Şekil 4C bakınız). </li><li> Kalın cidarlı tamir kordonu / fiber ayırıcı serbest uçlarında bir komütatör / dönel eklem takın. Onlar yama kablosu üzerine tork birikimini önler kemirgen hareketi ile fiber dönmesine izin gibi Komütatörler gereklidir. Çok fazla tork, kordonlar bükmek kırılmaya yol ve test sırasında hayvanın doğal hareketi engelleyebilir. </li><li> Komütatöre hayvan yama kablosunu takın. </li><li> Hayvan yama kablosu (Şekil 5) serbest metal halka sonuna kadar bir bağlantı bölünmüş kovanı takın. Tüm yol kadar halkalı kovanını zorlamayın; Bu hayvana yapıştırılmış implante fiber optik (Şekil 6) bağlanır ne gibi ~ kovanın 0.5 cm maruz bırakın. Kritik Adım: Her zaman bağlantı sırasında implante elyaf ferrüle üzerinde kovanın genişlemesine izin veren bir bölünme ihtiva kollu satın almak vekaldırma. Implanttan kol kesmek için çalışırken implant kafatası püskürmesi eğer uyum çok sıkı hayvana ciddi travmaya neden olabilir. Eğer bu gerçekleşirse, hayvan çalışmasında kaldırılır ve acil veteriner bakım almak gerekir. Benzer şekilde, ilk defa yeni bir manşon kullanmadan önce, takıp ve kuvvet istenen miktarda keser kadar halkalı fişini çekerek &#39;it kırmak&#39;. İpucu: sıkıca yüksük bağlı bir kol çıkarırken bir lif kırmak kolaydır. Bunu önlemek için, kovanın (standart pamuklu çubukla kolu sağ boyutu) açık ucuna küçük bir ahşap çubuk sokarak halkalı dışarı itin. </li><li> BNC kablosu kullanarak bir darbe üreteci için mavi lazer sürücüsünü bağlayın ve nabız jeneratörü açın. </li><li> Uygun koruyucu gözlük takın. Lazer &quot;Curr&quot; ve &quot;TTL +&quot; modu arkasındaki anahtarları ayarlayın. Emin tha olunsürücünün önündeki güç düğmesi sıfır set andturn lazer (ilk sürücüyü ve sonra lazer anahtar teslimi) t. </li><li> Bir ışık gücü ölçer kullanılarak ölçülen 10 mW hayvan yama kablosu fiber ucundan yayılan ediliyor - 5 böylece lazer önündeki güç düğmesini ayarlayın. 5-10 mW genel bir kılavuzdur - doku belirli bir hacmi Aravanis&#39;in ve ark, deney başlamadan önce hesaplanmalıdır etkileyecek gerekli tam güç yoğunluğu 3.. </li><li> In vivo uyarılması için mavi lazer için &quot;Analog&quot; mod Anahtarı. Not: Sarı DPSS lazerler sürekli aydınlatma TTL + modunda çalıştırılır. Lazer ısınmak için 10-15 dakika bekleyin. </li><li> Yavaşça fare dizginlemek ve kronik implante fiber hayvan yama kablosu bölünmüş-kol bağlamak (Şekil 6). Her iki lif uçları birbiri ile fiziksel temas etmesi emin olun. Bir şekilde bağlayarak kol bölünmüş kullanınPencere ikisi arasında doğrudan temas görselleştirmek için Kritik Adım:. Bazen enkaz hayvanın implante fiber metal yüksük toplamak ve düzgün bağlantı engelleyebilir. Bu durumda, yavaşça eklenmeden önce hayvanın kafasına yüksüğü temizlemek için silme bir etanol kullanır. Bu hayvana ciddi travmaya neden olabilir yüksük üzerinde bir bağlantı kovanı asla zorlamayın. Lif uçları arasında fiziksel bir bağlantı temizlendikten sonra yapılamaz Eğer çalışmada hayvan kaldırmak. İpucu: Hafif sızıntı implante lif ve hayvan yama kablosu arasındaki bağlantı noktasında meydana gelebilir. Kemirgenler tarafından bu ışığın Görselleştirme deneysel bulandırabilir 10 sunabilir. Isı küçültme boru yama kordonlar bağlı ve yabancı ışık aza indirmek için bağlantı noktasının üzerinde kaydırdı olabilir. </li><li> Fare davranış testleri başlamadan önce bir kaç dakika için geri izin verin. İpucu: Dtaşıma strese neden olabilir ve davranışsal test yanıltabilecek hayvan bağlamak için gerekli, 3 gün önce - davranışsal test epending 2 bağlantı ve bağlama işlemi fareler alıştırarak en iyisidir, tatbik edilecek. </li><li> Konektör kablosu kırılmaların serbest olmasını sağlamak davranışsal test cihazında fare yerleştirin. Stimülasyon sırasında gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. Hatta komütatörlerinin kullanımı ile, yama kordonlar uzun süre boyunca büküm eğilimi var ve davranış testi ile müdahale edebilir. </li><li> Seçim opsin aktive edecek bir önceden belirlenmiş frekansta mavi lazer pulse bir darbe jeneratörü kullanın. Sarı lazer kullanımı için: dış kepenkleri ile ya da sadece bir opak, yansıtıcı olmayan, yanmaz bir nesne ile ışın yolunu bloke ederek sarı lazer darbe. </li></ol> 4. Mesaj in vivo Stimülasyon Hususlar Bu bölüm, tam bir proto olması amaçlanmamıştırcol ama vivo Optogenetic uyarılmasını takiben düşünülmelidir ek işlemler için rehber olarak sunulmaktadır. <ol><li> Bir deneyin tamamlanmasından sonra, davranışsal sonuçların doğru yorumlanması için viral ve lif yerleştirme histolojik onaylayın. Kurumsal kurallarına göre hayvan Euthanize ve buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ve% 4 PBS (ağırlık / hacim) paraformaldehid ile hayvan serpmek. </li><li> Sıkıca pense veya hemostatlarla ile açıkta kalan metal halkalı tutarak implante fiber optik çıkarın. Bir pürüzsüz, ama hızlı, hareket yukarı çekin. Her deneyin sonunda, ışık çıkışının ölçülmesi yoluyla implante lifin bütünlüğü test edilmesi önemlidir. </li><li> Ilgi bölgesi boyunca kesit önce 48 saat - en az 24 paraformaldehid beyinleri Post-düzeltmek. (Donma mikrotomu kullanılarak ise, kesit birkaç gün önce bir% 30 sukroz çözeltisi içinde beyinleri inkübe). Standa kullanarak immunohistokimyasal gerçekleştirinUygun opsin-etiketli florofor tespiti için rd protokolleri, yani yeşil floresan protein (GFP), gelişmiş sarı floresan proteini (EYFP) veya MCherry. </li><li> Bir mikroskop altında opsin ifade ve lif implantın sitesini kontrol ve görsel seçilen koordinatlara dayalı virüs enjeksiyonu ve implanta uygun yerleşimi onaylayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools.">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147, 1446-1457 (2011).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+neural+interface:+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology.">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> J Neural Eng. 4, S143-156 (2007).</li><li>Sidor, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychiatry's+age+of+enlightenment:+optogenetics+and+the+discovery+of+novel+targets+for+the+treatment+of+psychiatric+disorders.">Psychiatry's age of enlightenment: optogenetics and the discovery of novel targets for the treatment of psychiatric disorders.</a> J Psychiatry Neurosci. 37, 4-6 (2012).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13, 251-266 (2012).</li><li>Nieh, E. H., Kim, S. Y., Namburi, P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+dissection+of+neural+circuits+underlying+emotional+valence+and+motivated+behaviors.">Optogenetic dissection of neural circuits underlying emotional valence and motivated behaviors.</a> Brain Res. 1511, 73-92 (2013).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li><li>Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+excitation/inhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction.">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 477, 171-178 (2011).</li><li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits.">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nat Protoc. 7, 12-23 (2012).</li><li>Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+identification+of+striatal+projection+neuron+subtypes+during+in+vivo+recordings.">Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings.</a> Brain Res. 1511, 21-32 (2013).</li><li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins.">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nat Methods. 9, 159-172 (2012).</li><li>Foutz, T. J., Arlow, R. L., McIntyre, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+principles+underlying+optical+stimulation+of+a+channelrhodopsin-2+positive+pyramidal+neuron.">Theoretical principles underlying optical stimulation of a channelrhodopsin-2 positive pyramidal neuron.</a> J Neurophysiol. 107, 3235-3245 (2012).</li><li>Tye, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety.">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li><li>Cardin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5, 247-254 (2010).</li><li>Chow, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463, 98-102 (2010).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nat Neurosci. 14, 387-397 (2011).</li><li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-stable+neural+state+switches.">Bi-stable neural state switches.</a> Nat Neurosci. 12, 229-234 (2009).</li><li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue.">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> J Vis Exp. , e50004 (2012).</li><li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13, 387-392 (2010).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96, 1803-1814 (2009).</li><li>Gradinaru, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li><li>Goshen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+retrieval+strategies+for+remote+memories.">Dynamics of retrieval strategies for remote memories.</a> Cell. 147, 678-689 (2011).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer:+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex.">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Front Syst Neurosci. 5 (18), (2011).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to report.

Mevcut açıklanan lazer set-up ve bağlama stratejileri kemirgen davranış testleri geniş bir yelpazede ile uyumludur. Nitekim, davranış testleri çeşitli izleyen kullanılan, ya da eşlik eden edilmiş, duygusal, davranışsal görevleri, davranış klima, öğrenme ve hafıza paradigmaları, uyku, uyarılma ve iştahlı görevleri şunlardır in vivo Optogenetic stimülasyon birkaç isim (Nieh ark bakın. 6 kapsamlı bir inceleme için). Optogenetik geleneksel davranış testleri birden fazla gün çalışmaları yapılmaktadır yolu artık davranış karşılaştırıldığı bir tek oturumda yoğunlaşmış olabilir değişti, karşı &#39;kapalı&#39; &#39;üzerinde&#39; ışık farklı çağlarda sırasında,-konular içinde 5. Notun, kapıları ihtiva davranış cihazları, kapalı bölmeler veya diğer engel gergin liflerin geçişini sağlamak için modifiye edilmesi gerekebilir. açıklanan bağlama stratejileri izin siTek bir lazerden gelen birden fazla farelerin multaneous uyarılması. Yüksek verim Optogenetic davranışsal test nedenle birden lazerler ve test ekipmanları kullanımı yoluyla elde edilebilir. aynı anda uyarılabilen hayvan sayısı, ancak, her lif uç elde edilebilir maksimum ışık enerjisi ile sınırlı olacaktır. Fiber ucundaki maksimum güç çıkışı lazer 1) başlangıç ​​gücü bağlıdır; 2) bağlanma verimliliği ve kiriş böler 3) sayısı. 200 mikron çekirdek, 0.22 NA fiber patch kablo kullanırken ~% 80 bağlanma verimliliğiyle ve (Şekil 4C gösterildiği gibi) 4 ışın böler, lif ucunda ortalama güce kadar 100 mW mavi lazer için 5-10 mW arasında değişebilir (nb &lt;olacak% 15 döner eklemler iletim kaybı bekliyoruz). Opsins nedenle ışık ve ışık güç yoğunluğu kendi hassasiyeti farklı olarak lif ucunda ışık çıkışı Ölçme mW (opsin aktivasyonu için yeterli ışık gücü belirlemek için gereklidir/ Mm2) aktivasyonu için gerekli olan 11. Örneğin, kararlı adım fonksiyonu opsin (SSFO) bir foton akümülatör gibi davranır ve bu nedenle aktivasyon için çok az ışık güç yoğunluğu (&lt;8 uW / mm 2) gerektirir 8. Aksiyon potansiyelleri ortaya çıkarmak için ışık 1 mW / mm 2 en az gerektirir geleneksel kanal rodopsin (ChR2) bu Karşılaştırması 2. Tablo 1 şu anda en yaygın opsins etkinleştirmek için gerekli minimum ışık bilinen ışık şiddetlerinin için hızlı bir referans olarak verilmiştir kullanın. Son olarak, bir o ışık scatter düşünün ve daha hafif güç derin beyin yapıları 3 için gerekli olan bu tür beyin dokusu üzerinden geçecek gibi emer gerekir. Yararlı bir online kaynak mevcuttur <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php">http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php</a> içine alarak beyin dokusu boyunca çeşitli derinliklerde ışık yoğunluğunu hesaplamak olacakFiber çekirdek boyutu, sayısal diyafram, kullanılan ışığın dalga boyunu ve lif ucunda başlayan ışık gücü oluşturmaktadır. Bu hesaplamalar altında yatan teorik ilkeleri mükemmel bir bakış için, Foutz ark bakın. (2012) 12. Deneysel tasarım bu ilkeleri ve hesaplamaları nasıl uygulanacağını örnekleri (2007) 3. Aravanis&#39;in ark gösterdi ve Tye ve ark. (2012) 13 edilmektedir. Bir deney başlamadan önce bu hesaplamaları Sahne opsin aktivasyonu için yeterli ışık ışınlama sağlamak için önemlidir. Bu hususlar göz önüne alındığında, yeterli güç çıkışı sağlamak için yüksek enerjili lazerler satın avantajlıdır. 100-200 mW arasında bir güç çıkışına sahip Lazerler küçük çekirdek lifleri, çoklu lif bölme, birleştirme verimsizlik telafi etmek için genellikle yeterli ve iletim 7 kaybeder. Yüksek güç lazerler kullanarak Ancak, bakım nöral hasar veya ısı ve ışık ilişkilendirmek önlemek için alınması gerekenUzun süreli ve / veya yüksek enerjili ışık aydınlatma 7 ile oluşabilir d eserler. In vivo deneyler için güvenli aralık 75 mW / mm2 kadar olduğunu. 14 Satın alma lazer türüne karar göz önünde birçok faktör vardır gibi karmaşık bir mesele olabilir. Örneğin, doğrudan diyot lazerler diyot pompalı katı-hal (DPSS) lazerler yapmak ve bir laboratuar ortamında zamanla daha güvenilir daha istikrarlı ve tekrarlanabilir darbeli çıkış sağlar. Bazı durumlarda ise, doğrudan diyot lazerler kumanda gerilimi nedeniyle lazerin kontrol elektroniği ile diyot gönderilen akım sabit bir önyargı 0 V bile, daha düşük bir ışık gücü, ~ 0.1 mW yayabilirler. Bu &#39;kendiliğinden&#39; emisyon aynı lazer lazer emisyonunu yaptığından daha geniş bir spektrumu vardır, bu nedenle özellikle lazer ve birleştiricisi arasındaki dar bant-geçiş (ya da &#39;temizleme&#39;) filtre (parça listesine bakınız) yükleyerek azaltılabilir. Bu filtre aynı zamanda olacaklasing zaman% 50 ~ güç çıkışını azaltır, bu yüzden buna göre daha yüksek enerjili lazer satın. Bu sarı DPSS lazerler son derece hassas ve kararsız davranabilir ve hızlı bir darbe üreteci tarafından modüle eğer ömrünü azalttı dikkat edilmelidir. Sarı lazer gücünün ayarlanması TTL + modunda lazer çalışırken ışın yolu (Bölüm 1.7) yerleştirilir dış yoğunluk filtresi tekerlekleri sayesinde yapılmalıdır. Alternatif olarak, yeşil 532 nm DPSS lazer satın halorhodopsins ve archaerhodopsins hem etkinleştirebilirsiniz bir maliyet-etkin bir alternatif. Bir fiber sayısal açıklık (NA) tasarımı ve lazer düzeneği set-up için lif bileşenleri satın alırken göz önünde bulundurulması önemlidir. Bir optik fiber NA kabul edilen ve bir elyafın ucuna yayılabilen ışık ışınlarının açılarını belirler. Yüksek-NA fiber alt-NA fiber evlendirilen ise, önemli bir kayıp bu arayüzde meydana gelecektir, bu yüzden tutarlı wi olmak önemlidir<html> Tek bir kurulum içinde inci lif NA (veya NA ışık yolu boyunca artar sağlamak için). Işıklı beyin dokusunun hacmi lif NA etkisi beyin dokusu olduğundan son derece saçılma ve bir lazer kaynağından birleştiğinde ışık için &#39;Az dolu&#39; yüksek NA liflerini eğiliminde olacaktır, çünkü daha az önemlidir; 0.22 ve 0.37 arasında bir NA ile ancak optik lifler yaygın olarak kullanılmaktadır. Benzer şekilde, bir küçük-çekirdekli fiber daha büyük bir-çekirdek bağlanması da önemli kayıplara neden, bu nedenle her zaman hayvan implant lazer kaynağından ilerleyen zaman artan eşit veya çekirdek çapları kullandığınızdan emin olacaktır. Genel bir not, lif uçları her zaman kullanımda toz ve partikül birikmesini önlemek için zaman kapatılmalıdır. Bu iyi bir fikir düzenli temiz lif uçları ve konektörler (% 70 izopropil alkol iyi çalışıyor) maksimal ışık güç çıkışını sağlamak için, ve her gün deneylerini başlamadan önce bir &#39;kukla implant&#39; ile hafif güç çıkışını test etmek. &quot;&gt; Davranış testi sırasında, adım virüs enfeksiyonu, dışsal protein ifadesi, görünür ışık ve hayvan davranışı üzerindeki muhtemel doku ısıtma etkileri ve eser etkileri kontrol etmek için alınması zorunludur. Bu nedenle, uygun bir kontrol grubu hayvanları arasında olmalıdır bir kontrol virüsü ile transduced (örneğin, GFP, EYFP, mCherry) aynı ışık stimülasyon parametreleri alırsınız. Deneysel doğrulama analizi için kullanılan davranışsal veri olarak önemli bir son adım ilgi bölgeye uygun opsin ve fiber optik yerleştirme tamamen bağımlı olduğu sinyal ya da lif yerleştirilmesi ilgilenilen bölgesinde uygulama değildir. Özellikle, herhangi bir immünohistokimyasal sinyali tespit edildiğinde hayvanlarda veya hayvan için davranışsal veri deneyden çıkarılmalıdır. Buna ek olarak, ışık çıkışı test etmek için esastır hem cerrahi implantasyon ve tekrar otopsi öncesi lif ucu opsin aktivasyonu için yeterli ışık gücü sağlamak için. anima olarakŞiddetli ışık kaybı denemeden sonra fiber üzerinden oluştu mi (&gt;% 30) 9, bu hayvan için veri kaldırılması için dikkate alınmalıdır. Kaldırılması için Kriterleri priori kurulmalıdır. Son olarak, bir hedef alındığını beyin yapısı ve nöronal alt tiplerine bağlı olacaktır sinir ateş modüle için gerekli darbe frekansını, düşünmek gerekir. Yayınlandı Optogenetic ışık stimülasyon parametreleri ancak, nöral ateş modüle yeteneği bağımsız in vivo veya beyin dilim elektrofizyolojik kayıtlar ile teyit edilmelidir birden nöronal alt-türleri için mevcuttur. Bir lazer kullanılması ve lazer set up modifikasyonu ile usta hale geldikçe, farklı dalga boylarında kombinasyonları, tek bir hayvana birden fazla elyaf gergin ya da kombinasyon Optogenetik 8 aynı fibere teslim edilebilir. Çok dalga boyu uyarım kırmızı-shift hızlı bir gelişme verilen giderek daha önemli hale gelecektired 8 channelrhodopsins, mavi-kaymıştır hiperpolarizan opsins 15 mühendislik, iki durumlu adım fonksiyon opsins 8,16,17 kullanımı ve farklı aktivasyon spektrumları 11 opsins genel genişleyen listesi. Optogenetic araç kutusu Bu genişleme, karmaşık davranış devletleri yöneten rollerini belirlemek için içinde ve beyin bölgeleri arasında hem birden fazla nöral alt-türleri görülmemiş kontrolünü izin verecektir.

Optogenetik normal ve hastalık-ilgili davranışsal durumları sürüş nöral devre elemanları için arama sistemleri düzeyinde nörobilim devrim yarattı. ışığa duyarlı mikrobik opsins 1 işlevsel memeli hücrelerinde ifade edilebilir keşif yüksek uzaysal ve zamansal hassas 2 ile nöral aktivitenin görülmemiş denetimini ele geçirmesine ışık kullanarak platformu sağladı. Nöral aktivitenin manipülasyon geleneksel elektrofizyolojik veya farmakolojik yaklaşımlar aksine, Optogenetik heterojen nüfus içinde ve fizyolojik ilgili zaman ölçekleri de (tanımlamak genetik ya da mekansal projeksiyona dayalı) özel hücre tiplerinin kontrolü sağlar. bir sinir-optik arayüz daha sonra giriş hayvanlar 3 davranmak ışık iletimi için pratik bir araç sağladı. Bu nedensel test etmek için uyanık davranıyor kemirgenlerde tanımlanan nöral devrelerin gerçek zamanlı modülasyonu için sağladıNörolojik ve psikiyatrik hastalık 4-6 ile ilgili davranışsal devletlerin yönetiminde bu nöral devrelerin rolü. Optogenetik, bu nedenle, beyin aktivitesinin ve hayvan modellerinde davranışsal veya fizyolojik tedbirler arasında işlevsel ilişkiyi araştıran ilgilenen herhangi bir laboratuvar haline getirilmesi için güçlü bir araç temsil eder. Bir Optogenetic deney başarılı tasarım ve tamamlanması çeşitli adımlar ve düşünceler (Şekil 1) içerir. Mevcut protokol amacı uyanık davranıyor kemirgenlerde Optogenetic uyarılması gerçekleştirmek için gerekli teorik ve pratik bilgi ile birlikte, araç ve bileşenleri ile bireylere sağlamaktır. Şu anda, mikrobiyal opsin kanalları etkinleştirmek için kullanılan iki baskın dalga boyu aralıkları vardır: mavi spektrumları (genellikle 473 nm) ve yeşil-sarı spektrumları (genellikle 532 veya 591 nm). Lazerler ve ışık yayan diyot (LED&#39;ler) her iki d, ışık kaynağı olarak kullanılabilirbeyin dokusuna özgül ışık dalgaboylan eliver. in vivo olarak, kemirgen uyarılması için gerekli olan küçük bir çekirdek lifler halinde birleştiği zaman özellikle LED tarafından yayılan insicamlı olmayan ışık, ancak, hafif zor etkin iletim yapar. Uygun lazer düzeneği üzerinde karar vermek önemli bir ilk adımdır ve laboratuarda Optogenetik amaçlanan kullanımına bağlı olacaktır. Tek ön-birleştiğinde lazerler ve çift lazer sistemleri (Şekil 2): Geçerli protokol iki montaj ve kullanım kolaylığı açısından farklılık temel yapılandırmaları açıklanmaktadır. Üretici tarafından önceden birleştirilmiş Tekli lazer sistemleri esasen hazır gitmek gerekli hiçbir set-up ile küçük girişte ama az son kullanıcı özelleştirme dezavantajı var. Bir çift lazer sistemi aynı fiber aşağı iki farklı dalga boylarında teslim sağlar. Farklı dalga boyları etkinleştirmek için kullanılabilir sayede bu ayrımlar inhibe / kombinasyonal Optogenetik gelişine giderek daha önemli hale gelecektiruzaysal olarak ko-lokalize T hücre türleri. Bu, aynı zamanda photocurrents başlatılmış ve sırasıyla 7,8, mavi ve sarı ışık ile sonlandırılır bistabil basamak fonksiyonu opsins ile kullanım için gereklidir. Kullanıcı ekleyebilir veya gerektiği gibi ışın yolu bileşenleri (örneğin, dış panjurlar, ışın filtreleri, satır içi güç metre) kaldırabilirsiniz gibi çift lazer sistemleri de özelleştirilebilir. Nedeniyle çok yönlülük, dual lazer set-up Optogenetik laboratuarda kullanılan bir araçtır devam olacak eğer tavsiye edilir. Lazerlerin Kavrama, ancak, bir meydan okuma sunmak ve böylece, hızlı, kolay, ve güvenilir birleştirme mekanizması bu protokolde sağlanmaktadır. Bu protokol optik bileşenlerin montajını ayrıntıları ve 200 mikron çekirdek ve 0.22 sayısal diyafram (NA) ile adım-indeks modlu fiberler için optimize edilmiştir yama kablolarını ve bileşenleri kullanır, unutmayın. Farklı çekirdek boyutları ve NA, ancak tüm bileşenlerin ideal çekirdek açısından uyumlu olmalıdır, satın alınabilirboyut ve NA fiber bağlantı noktalarında ışık kaybını önlemek için. Seçenek olarak ise, bir elyaf bağlantısına, hafif daha büyük bir çekirdek büyüklüğüne göre daha küçük bir geçebilir; ve / ya da bir düşük-NA ek bir kayıp olmaksızın daha yüksek NA fiber. Bağ stratejilerin, yüksek verimli davranış testleri için birden fazla fare eşzamanlı olarak uyarılması için izin veren sağlanır. Resim protokoller davranış testi Kronik implante liflerin kullanıldığı varsayılmıştır, ancak akut stimülasyon protokolleri için modifiye edilebilir. Aynı kanül ilaçlar ve aynı yerde bir fiber optiğin ucu iletmek için kullanılabilir çünkü Akut implante lifler, farmakolojik manipülasyonu ile Optogenetic uyarımı birleştirilmesi için avantajlıdır. Bu liflerin, tekrarlanan takma ve çıkarma işlemi ile ilişkili doku hasarı azaltır ve elyaf sürekli yerleştirilmesi için açısından doğruluğunu artırır gibi kronik implante liflerin kullanımı, bununla birlikte, yüksek oranda çoklu günlük davranış testi için önerilirDoku aydınlatma 3. Burada anlatılan bağlama yapılandırmaları ile kombine edildiğinde, davranış güvenilir birden fazla gün boyunca kaydedilebilir. Fiber implantasyon sonrası Nitekim, güvenilir ışık iletimi bildirilmiştir ay 9 kronik stimülasyon ve davranışsal test paradigmalar, teorik, birden fazla gün ve haftalar boyunca yapılabilir ki böyle. Donanım bileşenleri Ek notlar içi yapılabilir maliyetli alternatifler ve ürünler de dahil olmak üzere, kendi bireysel ihtiyaçlarına uygun olacak en iyi ürünün okuyucu seçimi izin protokol eklenmiştir. Kurulum ve uygulama sırasında yararlıdır Önemli ipuçları da verilmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">1. Laser Set-up</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">100mW 473nm or 488nm Diode Laser System , &#60;2% Stability</td>
			<td style="width:59px;">Omicron</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">Luxx/Phoxx 473/488-100</td>
			<td style="width:245px;">Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">100mW 594nm DPSS laser</td>
			<td style="width:59px;">Colbolt</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0594-04-01-0100-300</td>
			<td style="width:245px;">04-01 series yellow laser; sensitive to back-reflection from fibers</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">200mW 532nm DPSS laser; 5% power stability</td>
			<td style="width:59px;">Shanghai Lasers</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">GL532T3-200</td>
			<td style="width:245px;">Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Non-contact style laser to multimode fiber coupler&#160;</td>
			<td style="width:59px;">OZ Optics</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HPUC-23-400/700-M-20AC-11</td>
			<td style="width:245px;">For use with dual laser set-up; Specs: 33mm OD for 400-700nm; FC receptacle, f=20mm lens with post mount laser head adapter #11</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 12&#34; x 18&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1213</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 10&#34; x 12&#34; x 1/2&#34;. 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1012</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 4&#34; x 6&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">MB4</td>
			<td style="width:245px;">For blue laser; dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact variable height clamp, 1/4&#34;-20 Tapped</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">CL3</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">3/4&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TR075</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">TR1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">PH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Pedestal Base Adapter</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BE1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Small Clamping Fork</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">CF125</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics with visible laser quality mirror</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">KM100-E02</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Neutral filter density wheel</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">NDC-50C-2M</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; Longpass dichroic mirror 50%</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DMLP505</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">KM100</td>
			<td style="width:245px;">For dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">20-piece hex wrench kit with stand</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TC2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1/4&#34;-20 cap screw and hardware kit</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HW-KIT2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Mounting base 1&#34; x 2.3&#34;x3/8&#34;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">BA1S</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">ADAFCB1</td>
			<td style="width:245px;">Dual FC/PC L-bracket also available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Breadboard lifting handles</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BBH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">&#216;1&#34; Bandpass Filter, CWL = 450 &#177; 2 nm, FWHM = 10 &#177; 2 nm</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FB450-10</td>
			<td style="width:245px;">For use with diode lasers that spontaneously emit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">2. Laser Coupling</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:304px;">! Laser protective eyewear</td>
			<td style="width:59px;">Various</td>
			<td style="width:65px;">One for every user at each wavelength</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;">! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Fiber optic cable tester</td>
			<td style="width:59px;">Eclipse</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">902-186N</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">One-step fiber connector cleaner</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FBC1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.75 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.75m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.5 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.5m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors, multimode&#160;</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Doric mini cube</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">DMC_1x2_FC-2FC</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact power and energy meter console</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">PM100D</td>
			<td style="width:245px;">Digital 4&#34; LCD</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">C-series slim power sensor 5-500mW</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">S130C&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Multiple detectors types are available; check with vendor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">3. In vivo Optogenetic Stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Multimode fiber splitters</td>
			<td style="width:59px;">FONT Canada</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">Large core fiber optic 1 X 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Arbitrary waveform function generator (2 channel)</td>
			<td style="width:59px;">Rigol</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DG1022</td>
			<td style="width:245px;">Can control up to 2 lasers at once</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Fiber optic rotary joint (commutator)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC*</td>
			<td style="width:65px;">6 to 8</td>
			<td style="width:127px;">FRJ_1X1_FC-FC</td>
			<td style="width:245px;">*Also available through Thorlabs and Prizmatix</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:304px;">Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">8</td>
			<td style="width:127px;">MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg)</td>
			<td style="width:59px;">Precision fiber Products</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">SM-CS1140S</td>
			<td style="width:245px;">Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Clear dust caps for &#216;2.5 mm ferrules (25/pkg)&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">CAPF</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">CAPF1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">Thick-jacketed patch cords (custom order)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic uyarılması ile elde edilen sonuçlar Davranış, kullanılan hayvan modeli ve modülasyon parametreleri hedef alınıyor nöral devre tamamen bağlıdır. Tirosin hidroksilaz mevcut gösterim amaçlı, dopamin, ventral tegmental alan nöronlar ya da VTA için :: Cre fareler sabit bir basamak fonksiyon opsin (SSFO) 8 ya da kontrol virüs (EYFP) ile transduse edilmiş, ve bir lif implantı kronik idi implante. TH :: Cre transgenik farelerin kullanılması sentezleme VTA TH + hücreler (dopamin) ile sınırlandırılmıştır opsin. 7 birden fazla fare eşzamanlı olarak uyarılması için geçerli açıklandığı lazer düzeneğini kullanarak elde edilen temsili davranış sonuçları tasvir etmektedir sağlar. Burada, fareler gergin ve (Şekil 4C&#39;de olarak 3 fare / lazer) ayrı lazer kullanarak aynı anda uyarılan ve lokomotor davranışını 1 saat boyunca kaydedildi. VTA dopamin nöronlarının tekrarlı uyarım ile sonuçlanmıştırstimülasyon süresi boyunca devam hiperaktif fenotip. Lokomotor davranış değişiklik yok EYFP farelerde görüldü (video 1). Davranış testlerinden sonra, immünohistokimya görsel olarak teyit edildi VTA dopamin sinir hücrelerinin ve elyaf yerleştirme (bakınız Şekil 7) doğru, viral hedefleme doğrulamak için gerçekleştirilmiştir. <img alt="Şekil 1," fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig1highres.jpg" /> In vivo Optogenetic uyarılması için Şekil 1. Deneysel adımlar. Tasarımı ve in vivo Optogenetic uyarılması yaparken katılan dört genel adımlar vardır. Bu protokol, özellikle davranıyor kemirgen derin beyin yapıları bir lazer ışık kaynağından ışık teslim yer alan adımları ayrıntıları ve 1) lazer sistemi montaj ve hafif bağlantıyı içerir; C 2) bağlama stratejilerininveri yorumlama için gerekli olan bir adım - yönergelere yüksek verimli davranış testleri için bir ışık kaynağına birden hayvanları ağlanıyor ve 3) sağlayan ışık teslimat için hedefleme stratejisini onaylamak için. Not: Bu protokol bağlama amaçlı kronik implante lifleri özel olmasa da, tavsiye ve davranış testi ile Optogenetic stimülasyon birleştirerek zaman üstlendi. Ung &amp; Arenkiel, 2012 18 ve hem de Sparta ark. Bkz, içi üretim ve kronik optik fiberlerin implantasyonu 2012 9. Katı çizgiler = Bu protokol kapsamındaki adımlar. <img alt="Şekil 2," fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig2highres.jpg" /> In vivo Optogenetic, stimülasyon için kullanılan Şekil 2. lazer sistemleri. (A) &#39;in vivo uyarım ile ilgili tek bir lazer sistemi. Bu lazer ph olduğunu<html> ysically üretici tarafından önceden birleştirilmiş ve küçük son kullanıcı set-up gerektirir. (B) Çift lazer sistemi. İki lazerler temassız tarzı coupler içine her ışın yolunu yönlendirmek için harekete aynalar aracılığıyla tek bir fiber içine birleştirilir. Bu (B) &#39;de gösterildiği çift lazer sisteminin en çok yönlü set-up gibi optik bileşenleri kaldırıldı veya gerekli ama daha verimli lazer bağlantı açısından bir meydan okuma sunuyor olarak eklenebilir. (C) şematik lazerlerin ve aynalar belirten yerleştirme ilgili lazer ışık demeti yolu (oklar) ile tasvir. Burada, dikroik ayna &quot;D&quot; bağlantı &quot;C&quot; ve ekli bağlantı yama kablosu içine aracılığıyla sarı dalga boylarını iletirken mavi dalga boyundaki ışığın saptırmak için kullanılır. B = mavi lazer; C = temassız tarzı elemanı; D = dikroik ayna; FW = filtre tekerleği; M = Ayna; Y sarı lazer =.= &quot;_ blank&quot; olsun&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. <img alt="Şekil 3," fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig3highres.jpg" /> Şekil fiziksel olmayan birleştirme protokolü kullanılan 3. (A) Kablo tester Alt:. Kablo test cihazı, doğrudan bir yama kablosu bağlı. Ekle kablo test cihazı bağlantı noktasını göstermektedir (B) Patch kabloları protokol boyunca anılan dış itibaren iç için:.. Düz-cleave bağlı beyaz zirkon bölünmüş kovanı ile siyah ceketli hayvan yama kablosu (FC) son, modlu fiber splitter, (aynı zamanda bir &quot;bağlantı kablosu&quot; olarak anılacaktır), kalın cidarlı yama çekin. Kalın ceketli yama kordonlar ekstra koruma için polivinil klorür (PVC) boru ile kaplanmıştır. Bu kablolar için, endüstri standardı renk kodları farklı elyaf türleri, portakal = modlu fiber ayırt etmek için kullanılır. Hayvan yama kordonlar vardır<html> ince davranış testi sırasında hayvan hareketi için esneklik sağlamak için ceketli. Kabloların kullanımda değilken / PC biter kapaklar FC yerleştirildiğinden emin toz unutmayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig4highres.jpg" /> (A), tek bir hayvana, (B), iki hayvan in vivo Optogenetic uyarılması için Şekil 4. Bağ stratejileri; . (C) üç ya da dört hayvan Olası yapılandırmalar yukarıda gösterilen bunlarla sınırlı değildir - Birden fazla yapılandırmaları ticari veya özel sipariş ile mevcut adaptörler, lif bölücülerin ve dallanma yama kordonlar eşsiz kombinasyonu ile mümkündür. Not: patch kablo ve fiber bölücülerin her iki ucunda FC / PC konnektörlerini içerirler (yalnızca bir uç tasvir edilir).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. <img alt="Şekil 5," fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig5highres.jpg" /> Şekil 5. Bölünmüş-manşon kullanılarak bir implant fiber optik bir yama kablosunun doğru ve yanlış (kırmızı x) bağlantısı. (Sol panel) bölünmüş kılıf zirkon A implante fiber optik (Burada gösterilen bir hayvan yapıştırılmış olan) yüksük bir yama kablosunu bağlamak için kullanılır. Ok yama kablosu ve implante fiber optik arasındaki bağlantı noktasına işaret ediyor. Bağlantı kovanının bölünmüş yoluyla görüntülendi gibi bir boşluk, yama kablosu ve implante fiber optik arasında var (Sağ panel) ile karşılaştırın. Bir yanlış bağlantı (sağ alt) ile oluşabilir ışık sızıntısını unutmayın. U üzerinde alt eklemepper sol panel kullanılmıştır bileşenleri tek tek gösteriyor. Dor implante fiber optik kanül, beyaz zirkon bölünmüş kovan, siyah ceketli hayvan yama kablosu düz-cleeve (YP) son (Şekil 3B tasvir tam yama kablosu): Yukarıdan ucun altına. Tüm panellerde, bağlantı kovan yama kablosu FC ucu ile aynı hizada olmadığını unutmayın. Bırakın ~ 0.5 cm bir-üzerinde asılı hayvan yapıştırılmış implante fiber optik bağlantı için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig6highres.jpg" /> Şekil 6. Yan (solda) ve frontal bir yama kablosu bağlı bir implante fiber optik bir fare (sağ) görünüm. Yama kablosu t uygun bağlantı görselleştirmek yardımcı bağlayan kol bölünmüş kullanınimplante fiber optik yüksük o. Bağlantı noktası kırmızı kesik kutu ile vurgulanır ve aynı zamanda üst ekleme tasvir edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig7highres.jpg" /> 7. Temsilcisi sonuçları Şekil. (Sol) in vivo Optogenetic stimülasyon Davranış okuma. Tarif edilen lazer kurulum ve bağlama protokolü kullanılarak elde edilebilir davranış örneği. Ya bir basamak fonksiyon opsin (AAV5-DIO-SSFO-EYFP ile transduse - lokomotor aktivitesi, ventral tegmental alan tirozin hidroksilaz (VTA) (TH) :: Cre fareleri (8 / grup, n = 7), Optogenetic uyarılması sırasında kaydedildi ) veya kontrol virüsü VTA&#39;da içinde (AAV5-DIO-EYFP). Üç farelerin grupları aynı anda tek bir gergin edildiŞekil 4C&#39;de gösterilen ve 447 ya da 473 nm ışık maddenin 5 saniyelik bir darbe ile uyarılmış lazer her 15 dakikada bir teslim edilir. İki yönlü tekrarlı ölçümler ANOVA Optogenetic stimülasyon lokomotor aktivite artışı sayede önemli bir grup x zaman etkileşim (F 3,39 = 15.27, p &lt;0.0001) ve önemli bir zaman temel etkisi (F 3,39 = 4.67, p = 0.007) saptandı Sadece (göreceli Bonferroni post-hoc p &lt;0.0001, = 0 t - 15 kez bin) SSFO farelerde EYFP farelerin (grubun ana etkisi ile karşılaştırıldığında lokomotor aktivitede genel artmasına neden: F 1,39 = 10.69, p = 0,0061; t = 15 de Bonferroni post-hoc p &lt;0.01 - t 30 ve p &lt;0.001 = 30-45 ve t = 45-60). Elyaf özellikleri: 200 mikron çekirdek, 0.22 NA. Önce gerilmesinden fiber ucunda yayılan 5 mW ışık gücü ile viral enjeksiyon sitesinden 0,6 mm - Işık radyasyonu = 6 - 0.1 lif ucu mesafeye tekabül 66 mW / mm2,. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. EYFPSSFO vs: ** p &lt;0.01; *** P &lt;0.001; Zaman etkisi: #### p &lt;0.0001, viral ve fiber optik yerleştirme (Sağ) histolojik onay.. Leica TCS SP5 tarama laser mikroskop ile elde edilen Konfokal floresan görüntü elyaf yerleştirme (noktalı çizgi) ve in vivo olarak Optogenetic uyarım, fare, ventral tegmental alan viral aracılı ekspresyonunu (yeşil) görselleştirmek için kullanılmıştır. Dopamin nöronları (TH +) mavi görülür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> In vivo Optogenetic stimülasyon Video In: 1.. Hiperaktivite TH :: Cre farelerde SSFO kullanarak VTA uyarılması sırasında <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/JOVE_video_1.mov" target="_blank">bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspili = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="5"> Tablo 1. Işık Irradiances yaygın olarak kullanılan opsins etkinleştirmek için gerekli. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Opsin Varyant </td><td rowspan="2"> λ </td><td rowspan="2"> Güç Yoğunluğu (/ aa 2) </td><td></td><td rowspan="2"> Özellikler </td></tr><tr><td> / Kapalı Kinetiğine </td></tr><tr><td colspan="5"> Optik uyarım: Hızlı etkili channelrhodopsins </td></tr><tr><td> ChR2 2 </td><td> 470 </td><td> 1 - 5mW </td><td> 1.21 / 12 msn </td><td> 40 Hz kadar Yangınlar </td></tr><tr><td> Cheta 19 </td><td> 490 </td><td> 5 mW </td><td> 0.86 / 8.5 msn </td><td> 200 Hz kadar Yangınlar </td></tr><tr><td> ŞEFİ 20 </td><td> 450 </td><td> 1.65 mW </td><td> 1.62 / 12 ms </td><td> ChR2 olmayan desensitizan formu </td></tr><tr><td rowspan="2"> C1V 18 </td><td rowspan="2"> 540-630 </td><td> 8 mW (540 nm&#39;lik) </td><td> 54 at 5/34 msn0nm </td><td rowspan="2"> Kırmızı-kaymıştır </td></tr><tr><td> 3.2 mW (630 nm) </td><td> 67 msn (on) 630 nm &#39;de </td></tr><tr><td colspan="5"> Optik uyarım: Yavaş hareket eden kanal rhodopsins </td></tr><tr><td> Kararlı adım fonksiyonu opsin (SFO) 8 </td><td> 470/590 </td><td> 8 uW (470 nm&#39;de) </td><td> 20 milisaniye / 29 dak </td><td> Yeni SFO varyantı; uzun süre açık devlet. 590 nm tarafından kapatıldı, 470 nm ile Açıldı </td></tr><tr><td colspan="4"> Optik İnhibisyon </td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> eNpHR3.0 21 </td><td rowspan="2"> 560-630 </td><td rowspan="2"> 3-5 mW </td><td rowspan="2"> 2.5 msn / &lt;10 msn </td><td> Sabit ışık ile 30 dakika 22 Sürekli önleme * </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> ArchT3.0 11, 23 </td><td> 520-560 </td><td> 1-5 mW </td><td> 2 / &lt;10 msn </td><td> ENpHR3.0 &lt;daha büyük photocurrents ile daha hassas/ Td&gt; </tr><tr><td colspan="5"> Bu tablo sadece bir kılavuz olarak verilmiştir; nöral modülasyonu için gerekli özel ışık Irradiances bağımsız teyit edilmelidir. </td></tr><tr><td colspan="5"> Deneysel doğrulama opsin, hedefleme stratejisi ve hafif stimülasyon parametreleri istenilen şekilde 5 nöral ateşleme modüle doğrulamak için önemlidir. </td></tr><tr><td colspan="5"> Güç yoğunluğu (mW / mm2), beyin dokusu belirli bir alan üzerinde ışıklı ışığın gücünü ifade eder ve fiber ucundan yayılan ışık gücü ile ilgili değildir. </td></tr><tr><td colspan="5"> * Her zaman, özellikle uzun süreli ışık uyarımı ile, mümkün olan en düşük ışık yoğunluğunu kullanın. </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Işık Irradiances yaygın olarak kullanılan opsins etkinleştirmek için gerekli. Kısaltmalar AAV adeno-ilişkili virüs = DPSS = diyot pompalı katı hal <br/&gt; EYFP = gelişmiş sarı floresan proteini FC / PC = düz cleave / fiziksel temas GFP = yeşil floresan proteini PBS = fosfat tamponlu salin PVC polivinil klorür = Mw = miliwat NA = sayısal açıklık SSFO istikrarlı adım fonksiyonu opsin = TH = tirosin hidroksilaz TTL = transistör-transistör mantığı V = gerilim VTA = ventral tegmental alan

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System at JoVE.com

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

in-vivo-optogenetic-stimulation-of-the-rodent-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

59.0K Görüntüleme.  University of Pittsburgh Medical Center. Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Video: In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Kemirgen Modeller Merkezi Sinir Sistemi Hastalıkları Tedavisinde Sistemik ve Yerel İlaç Taşıyıcı

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Nörobilim

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Optik Sinir transeksiyonu: Santral Sinir Sistemi Yetişkin Nöron Apoptoz Bir Model

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Merkezi sinir sisteminin transducing Hücreleri için lentiviral Vektörler Üretimi

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Santral Sinir Sistemi Onarım İnceleyecek Bir Sakatlık Paradigma<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

Polyribosome Fraksiyonu tarafından Santral Sinir Sistemi Translatome in vivo sorguluyor

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...