Mevcut protokol, yetenekli motor davranışın altında yatan beyin mekanizmalarının incelenmesine katkıda bulunmaktadır. Kablosuz optogenetik, denekler serbest dolaşımda bir görevi yerine getirirken belirli nöronların manipülasyonuna izin verir. Yüksek hızlı videografi ile birlikte, ince motor davranışının ayrıntılı bir analizini yapmak mümkündür.
Yöntem, nörogelişimsel ve nörodejeneratif bozukluklardaki motor problemlerin anlaşılmasına yardımcı olabilir. Bu teknikler, diğer davranışsal paradigmalarda da beyin fonksiyonlarını incelemek için kullanılabilir. Laboratuvarımdan bir lisans öğrencisi olan Diana Rodriguez-Munoz, deneye yardımcı olacak.
Cerrahi prosedürler için, ilgilenilen yapının dorso-ventral koordinatlarına göre istenen uzunlukta bir LED kanül hazırlayarak başlayın. Bunu yapmak için, cam elyafını istenen son boyuttan daha uzun bir uzunluğa kadar kesin ve elyaf ucunu kaba zımpara kağıdı ile hedef uzunluğa kadar öğütün. Ardından, fiber ucu ince zımpara kağıdı ile cilalayın.
Mikroenjeksiyonlar için, bir pipeti mineral yağ ile doldurun ve pipeti mikroenjektöre yerleştirin. Bazı mineral yağları enjekte ederek mikroenjektörün doğru çalıştığından emin olun. Daha sonra, anestezi uygulanan fareyi oftalmik bir merhem uygulayarak ve saç derisinden bir düzeltici ve epilasyon kremi ile saç çıkararak ameliyat için hazırlayın.
Daha sonra, kafa derisini% 8 povidon iyot ve% 70 etanol içeren pamuklu çubuklarla silin. Sanitizasyondan sonra, fareyi stereotaksik aparata yerleştirin ve kafatasının medial-lateral ve anterior-posterior eksenlerde düzleştirilmesini sağlayarak kafayı sabitleyin. Sagital eksen boyunca göz hizasında kafa derisinden bir santimetrelik bir kesi yapmak için bir neşter kullanın.
Ardından, kafatasını açığa çıkarmak için cildi geri çekin ve periostu pamuklu çubuklarla temizleyin. Kafatası yüzeyini tuzlu su çözeltisi ve pamuklu çubuklarla temizleyin ve steril emici göz mızrakları kullanarak yüzeydeki kanamaları çözün. Daha sonra, pamuklu çubukla %2,5'lik bir damla hidrojen peroksit uygulayın ve kafatası dikişlerini görünür kılmak ve daha iyi bir referansa sahip olmak için birkaç saniye boyunca hareket etmesine izin verin.
Birkaç saniye sonra, bölgeyi temiz bir pamuklu çubukla iyice temizleyin. 15 mikron nihai uç çapına sahip bir cam pipetle, kafatasının ön-arka eksende düzleştirilip düzleştirilmediğini kontrol etmek için bregma ve lambda'yı bulun. Ardından, kafa derisindeki bir referans noktasını seçilen koordinatların üzerinde bir işaretleyici ile boyayın.
Referans noktasında, küçük, yuvarlak bir dental matkap ucu ile düşük ila orta hızda döner bir aletle kafatasına hafif basınç uygulayan bir milimetre çapında bir kraniyotomi gerçekleştirin. İşiniz bittiğinde, kılcal damarı seçilen ön-posterior veya AP ve medial-lateral veya ML koordinatlarına doğru hareket ettirin. Kılcal damarı, CreE'ye bağımlı adeno ilişkili virüsün 300 ila 400 nanolitresi veya AAV1, D-flox channelrhodopsin mCherry gibi AAV ile yükleyerek ilgilenilen bölgedeki channelrhodopsin eksprese edin.
Bir AAV, muhabir proteinini eksprese etmek için bir kontrol olarak kullanılabilir. Ucun tıkanmadığından emin olduktan sonra, cam pipeti beyinde dorso-ventral eksi 3.35 milimetre koordinatlarında dorsal-lateral striatumda tanıtın ve saniyede 23 nanolitre hızında otomatik bir enjektör kullanarak virüsün 200 nanolitresini enjekte edin. Dökülmeyi önlemek için cam pipeti yavaşça çekmeden önce enjeksiyondan sonra 10 dakika bekleyin.
Ardından, kalıntıları pamuklu çubuklarla temizleyin ve kurutun. Ardından, cam LED kanülü stereotaksik kola takın ve referans olarak bregma kullanarak koordinatları kalibre edin. Ardından, doku hasarını önlemek için kanülü yavaşça yerleştirin ve enjeksiyon bölgesinin 100 mikrometre yukarısına yerleştirin.
LED kanül yerleştirildikten sonra, kraniyotominin kenarına 100 mikrolitre doku yapıştırıcısı damlası ekleyin. Kanül konektörünün etrafına azar azar taze hazırlanmış bir diş çimento karışımı uygulamak için steril bir fırça kullanın, kafatası kaplanana ve konektör kafatasına güvenli bir şekilde tutturulana kadar katmanlar oluşturarak pimleri tamamen serbest bırakın. Çimento tamamen kuruduğunda, doku yapıştırıcısı kullanarak implantın etrafındaki cildi kapatın.
Ardından, rahatsızlık veya ağrı belirtilerini izlerken fareyi 33 santigrat derecede bir ısıtma yastığı üzerinde bir kurtarma kafesine yerleştirin. Hayvanın davranışını normal bir kamerayla kaydedin ve odanın önünden saniyede 30 ila 60 kare yakalayın. Hayvanın duruşunu izlemek için eğitim odasının altına 45 derecelik bir açıyla bir ayna yerleştirilebilir.
Fareler pelet üzerinde ulaşmaya başladığında, davranışın iki saniyeden fazla gerçekleştirilmemesi için sürekli bir stimülasyona sahip olmak için LED kanülü uzaktan kumanda ile manuel olarak çevirin. Stimülasyon cihazı, milimetre kare başına bir miliwatt'ın ucunda yoğunluğa sahip 470 nanometrelik bir LED'i tetikler. Optogenetik manipülasyonlar altındaki hayvanın ince motor davranışı, kavrama yeteneği ile incelenmiştir.
Fareler görevi birkaç gün içinde yerine getirmeyi öğrendiler ve% 55'ten fazla doğruluk elde ederek beş günlük eğitimden sonra bir platoya ulaştılar. Hareketlerin yörüngesi, kinematiğin analiz edilmesini mümkün kılan yüksek hızlı videografi ile izlendi. Kat edilen mesafe, hız, ivmelenme, bitiş noktası ve yörünge gibi parametrelerin ölçülebilir değerlendirmesi yapıldı.
Kaçırılan denemelerde, fareler kavrama hareketini peletten vuruş denemelerinden daha uzakta başlattılar. Ek olarak, hatalar, vuruş ve kaçırılan denemeler sırasında vücut açısındaki farklılıklarla gösterilen fare duruşuyla önemli ölçüde ilişkiliydi. Dikenli projeksiyon nöronlarını veya SPN'leri eksprese eden D1 dopaminin kontralateral aktivasyonu, kontrol koşullarına kıyasla kavrama başarısını azaltmıştır.
Bir optogenetik stimülasyon sırasında, pençe yörüngesi seyahat mesafesinde artmış, bu da peleti hedefleyememeye ve ilk hata tipi birde bir artışa yol açmıştır. İlke bileşen analizi veya PCA, kontralateral D1 SPN'lerin aktivasyonu sırasındaki tüm deneme yörüngelerinin, kontrol kümesiyle neredeyse hiç örtüşmeyen bir kümede ayrıldığını ve bunun düşük bir benzerlik gösterdiğini göstermiştir. DSPN'lerin ipsilateral tarafta aktivasyonu, PCA analizi ile gösterilen yörünge dağılımında bir artışa yol açmıştır.
Bu nedenle, ipsilateral D1 SPN'lerin aktivasyonu, davranışsal sonucu değiştirmeden ulaşma yörüngesini değiştirdi. Bu protokolü uygularken, kanülü doğru bir şekilde yerleştirmeye dikkat edin, böylece eğitim oturumları sırasında ayrılmaz. Bu yöntem, motor davranışı, duyusal işlemeyi, öğrenmeyi ve hafızayı incelemek için diğer davranışsal paradigmalarda kullanılabilir.
Kablosuz optogenetik, gerçekten serbest hareket eden deneklerde natüralist davranışı ve nörobiyolojik temellerini incelemeye izin verecektir.
