Bu makalede açıklanan araştırma, Kanada Yenilik, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi, Saskatchewan Üniversitesi, Saskatchewan Hükümeti, Batı Ekonomik Çeşitlendirme Kanada, Ulusal Araştırma Konseyi Kanada ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri tarafından desteklenen Kanada Işık Kaynağı'ndaki BMIT tesisinde gerçekleştirildi. Yazarlar, Kanada Işık Kaynağı'ndaki beamline bilim adamlarına, özellikle Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov ve Ning Zu'ya SkyScan SRμCT ve beyaz ışın mikroskop sistemlerinin kurulumu ve sorunlarının giderilmesindeki yardımları için teşekkür etmek istiyor. Ayrıca Toledo Üniversitesi Tıp ve Yaşam Bilimleri Koleji'nden Beth Dalzell'e ve Kuzeydoğu Ohio Tıp Üniversitesi'nden Dr. Jeffrey Wenstrup'a bu çalışma için kadavra örneklerine erişim için teşekkür ederiz. JM Andronowski, Akron Üniversitesi ve Adli Bilimler Adli Bilimler Ulusal Adalet Araştırma ve Geliştirme Enstitüsü tarafından sağlanan başlangıç araştırma fonları (2018-DU-BX-0188) ile desteklenmektedir. RA Davis, Akron Üniversitesi tarafından sağlanan bir lisansüstü asistanlık tarafından desteklenmektedir. Koring ve testereleme için kullanılan ekipman ve malzemeler, Akron Üniversitesi ve NSF tarafından CW Holyoke'ye EAR-1624242 hibesi tarafından sağlanan başlangıç fonları tarafından satın alındı.

Tüm örnekler, Toledo Üniversitesi, Tıp ve Yaşam Bilimleri Koleji ve Kuzeydoğu Ohio Tıp Üniversitesi'ndeki (NEOMED) mumyalanmış kadavra donörlerinden, bağışçının kendilerinin veya donörün en yakın akrabasının bilgilendirilmiş onayıyla elde edildi. Akron Üniversitesi İnsan Denekleri Koruma Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB), bu örnekleri yaşayan bireylerden temin edildikleri için tam IRB incelemesinden muaf gördü. Yaş, cinsiyet ve ölüm nedeni gibi demografik bilgiler tüm bağışçılar için mevcuttu. Seçilen bireyler, ölüm anında kemik tadilatını etkileyebilecek kemik etkileyen durumları veya tedavi rejimlerine maruz kalmayı belgelemediler. Kadavra modern erkek ve kadın femorasından yaşları 19 ile 101 arasında değişen (ortalama = 73,9 yaş) kortikal kemik örnekleri alındı. Femoral midshaft, kortikal gözeneklilik20 , 21,22,23,24ve kemik dokusunun malzeme yoğunluğu25 ,26,27varyasyon incelemeleri de dahil olmak üzere kapsamlı bir şekilde çalışılmış ve böylece mikroyapısal analizler için yaygın olarak kullanılan bir yerhalinegelmiştir.
1. Doku Temini ve Maceration
<ol><li>Sol femoranın orta diafizlerinden ~7,5 cm kemik blokları temin etmek için dalma kesme karbür bıçağı (kompozit malzemeler için) ile donatılmış salınımlı bir testere kullanın.</li>
	<li>Femoral blokları toz proteaz enzimi ve musluk suyu çözeltisi ile dolu fırın güvenli bir cam kabın içine 45 °C'de ayarlanmış bir inkübatörde 1 saat bekletin.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, künt diseksiyon veya diş aletleri kullanarak kalan yumuşak dokuları ve periosteumu dikkatlice çıkarın. NOT: Yumuşak dokuları çıkarmak için keskin aletler (örneğin neşter) kullanmaktan kaçının. Bu tür aletler, μCT taramalarında tespit edilebilen kemikte hasara neden olabilir, numune korumasını ve tarama veri kalitesini etkileyebilir.</li>
	<li>Kemik bloklarını ultrasonik bir temizleyiciye 20:1 parça musluk suyu ile 5-10 dakika boyunca temizleyerek (bkz. Malzeme Masası)veya el tipi su ipi (örneğin, Waterpik) kullanarak medüller boşluktaki döküntüleri veya tıkanıklıkları giderin.</li>
	<li>Kemik bloğunu bir numune kabına batırın ve% 70 etanol ile doldurun. Lipitleri çıkarmak için kemiğin en az 24 saat ıslamasına izin verin. NOT: Ksilenler lipitleri çıkarmak için de kullanılabilir. Bununla birlikte, ksilenlerde uzun süre ıslatmak, emülgatör olduğu için kemiği kırılgan veya tebeşirli hale getirebilir.</li>
	<li>24 saat sonra, kemik bloklarını etanolden çıkarın ve ortam sıcaklığında 24-48 saat boyunca kurumaya bırakın. NOT: Protokol burada duraklatılabilir.</li>
</ol>2. Doku kesitleri
<ol><li>140 °C'ye ayarlanmış bir sıcak tabağa 75 x 25 mm cam mikroskop kaydırağı yerleştirin. Slaytın ortasında çok miktarda termal epoksi reçinesi eritin (bkz. Malzeme Tablosu).<ol>
<li>Mikroskopi (<50 μm) için ek ince bölümler hazırlıyorsanız, trabeculae'yi korumak için kemik bloğunun iki parçalı bir epoksiye gömülmesi gerekebilir. Ayrıca, kırılgan numuneler (örneğin, diagenetik kemik veya yüksek trabekülerize numuneler) için bu protokolü uygularken, örnekleri bir epoksiye gömmek gereklidir. NOT: Bu protokolde kullanılan kemik örnekleri mumyalanmış kadavra örneklerinden alındı. Taze örnekler otopside veya SRμCT yoluyla yumuşak doku yapılarını (örneğin vaskülat) incelemek için cerrahi bir vakadan toplanırsa, epoksi ile emprenye bu tür dokulara zarar verebilir. Bu durumlarda, alternatif bir yapıştırıcı veya montaj ortamı önerilir (örneğin, çift taraflı bant, modelleme kili).</li>
	</ol></li>
	<li>Kemik bloğunun alt yönünü mikroskop kaydırağındaki termal epoksi reçinesine, kemiğin uzunluğu slayda dik olacak şekilde bastırın. Kemiğin altını kaplamak ve slayda güvenli yapıştırma sağlamak için numuneyi ileri geri kaydırın.</li>
	<li>Termal epoksinin gözeneklere ve/veya çatlaklara fitillenebilmesi için monte edilen numuneyi sıcak plakada ~5 dakika dinlendirin. NOT: Slayttaki epoksi, en iyi yapıştırma için kabarcık içermemelidir. Kabarcıkları kaldırmak için örneği slaytta ileri geri kaydırın. Kabarcıklar genellikle kemiğin içinde sıkışan su ve/veya etanol nedeniyle oluşur ve buharlaşır.</li>
	<li>Monte edilmiş numune ile kaydırağı künt forseps kullanarak sıcak plakadan çıkarın ve oda sıcaklığında ~10 dakika soğumaya bırakın. Aynanın slaydı yeterince kavramasını sağlamak için jilet kullanarak slaydın kenarından herhangi bir epoksiyi çıkarın.</li>
	<li>Yapışık numune ile slaydı bir cam slayt aynasına takın ve mandreni yavaş hızlı bir kesit testeresinin döner koluna monte edin (bkz. Malzeme Tablosu, Şekil 2). NOT: Bu protokolde bir Buehler IsoMet testeresi kullanılırken, IsoMet yerine kullanılabilecek başka hassas kesit testereleri de mevcuttur (örneğin, Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire).</li>
	<li>Bıçağın numuneye temas etmesini ve transekte etmesini sağlamak için konumlandırma kadranını kullanarak döner kolu ayarlayın. Numuneyi, kemiğin bir kesiti uzunluğuna dik kesilecek şekilde konumlandırın.</li>
	<li>Kolun ağırlığına karşı koymak için kesme kolunun uzak tarafına ağırlıklar ekleyin. NOT: Yetersiz karşı ağırlık kullanılırsa, numune bıçağın üzerinde dayanabilir ve bıçağın kırılmasına neden olabilir.</li>
	<li>Testerenin sıvı haznesine kesme sıvısı (kesme sıvısına 20:1 parça su) ekleyin.</li>
	<li>Elmas gofret bıçağını sıkıca sabitleyin ve sıvı seviyesinin bıçağın kesme kısmını batırmasını sağlayın. Hızı 200 RPM olarak ayarlayın ve numuneyi yavaşça bıçağın üzerine 200 RPM'ye 200 ayarlayın (Şekil 3).</li>
	<li>Bıçak ve mandrenin sallanmamasını ve/veya zıplamamasını sağlayın. Aşırı hareket dikkat edilirse, kesmeye devam etmeden önce testereyi derhal durdurun ve bıçak ve/veya ayna kolu montajını sıkın. Mandren agresif bir şekilde yukarı ve aşağı hareket ediyorsa ek karşı ağırlıklar ekleyin. Görünür yan yana hareket de dahil olmak üzere aşırı hareket bıçağın kırılmasına neden olabilir.</li>
	<li>İlk kalın bölüm, her ek kesime paralel olarak iyi tanımlanmış bir yüzey sağlamak için bir 'atık kesimi'dir. İlk atık kesildikten sonra, döner kolu kaldırın ve konumlandırma kadranını kullanarak mandreni 5 mm'ye doğru hareket ettirün. Bu yöntemle mikroskopi için daha kalın bölümler (~1 mm) daha fazla toplanabilir. NOT: Değerli doku tasarrufu sağlamak için atık kesimi atlanabilir. Bununla birlikte, bir numuneyi düzensiz bir kenarla bölümlerken, numunenin zirvesinin teğetsel olarak koring matkap ucunun kenarına dizilmesi önemlidir.<ol>
<li>Kesirleme yaparken bıçağın kerf'ini hesaba kattığınızdan emin olun. Örneğin, 0,5 mm'lik bir kerf içeren bir bıçaktan 5 mm'lik bir bölüm almak için numuneyi hareket ettirip 5,5 mm'yi bıçağa doğru fırlatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Bölümleme tamamlandıktan sonra, termal epoksiyi eritmek için monte edilmiş numune ile cam kaydırağı sıcak bir tabağa yerleştirin. Bu, kemik blokların slayttan hızlı bir şekilde çıkarılmasını sağlar. NOT: Protokol burada duraklatılabilir.</li>
</ol>3. Örnek koring
<ol><li>2.2-2.4 adımlarında açıklandığı gibi termal epoksi yapıştırma tekniğini kullanarak sığ bir alüminyum tenekenin altına (~8 cm çapında) 5 mm kemik bölümleri monte edin.</li>
	<li>Tenekeyi freze matkap presinin XY makine masasına yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu)ve elle sıkma sabitleme kelepçeleri (Şekil 4).</li>
	<li>Değirmen delici mandrenine 2 mm iç çaplı içi boş şaftlı kuyumcunun elmas uçlu koring matkap ucu (bkz. Malzeme Masası)yerleştirin. Tenekeden korselenmeyi önlemek için derinlik sınırlayıcıyı ayarlayın (Şekil 5).</li>
	<li>Periosteum, endosteum veya yüksek trabekülerize alanlarla yakın temastan kaçınırken kemik örneğinin merkezi ön yönünü matkap ucunun altına hizalayın. NOT: Kortikal kalınlık bireyler arasında, özellikle artan yaşla birlikte değiştiğinden, orta-ön femoral kortizlerin otomatik seçimi mümkün değildir.</li>
	<li>Numuneyi tamamen örtmek için tenekeyi damıtılmış suyla doldurun. Bu, ısı birikmesini, numunenin yanmasını ve/veya koring sırasında matkap ucunun zarar görmesini önler. NOT: Koringin neden olduğu ısı hasarı olasılığını değerlendirmek için, koring ucu kemiklerin yüzeyine ilk kez nüfuz ettiği için damıtılmış sudan sıcaklık okumaları elde etmek için kızılötesi bir termometre kullanılmıştır. Sıcaklık, bu test için korselenen on örnek arasında 22,9 - 23,9 °C arasında 1 °C arasında değişmektedir. Bu nedenle, ısı kaynaklı hasarın ihmal edilebilir olduğunu savunuyoruz.</li>
	<li>Çekirdek biti ve kemik arasındaki ilk birkaç temas örneği için, kemiğin üst yüzeyinde bir halka takmak için hafif basınç uygulayın. Bu, koring işleminin başında matkap ucunun sapmasını önler ve ucun doğru yerleştirilmesini sağlar.</li>
	<li>Koring sırasında, ucu su yüzeyinin altında tutarken matkap ucunu numunenin içine ve dışına kaldırın. Sıkışmış kemik tozunu temizlemek ve kalıntıların matkap ucunu tıkamamasını sağlamak için bu tekniği birkaç saniyede bir sürdürün. NOT: Çekirdek konik bir şekil oluşturuyorsa, muhtemelen 1) kemik tozunu coring bitinden temizlemek için yeterli zaman izin vermiyor ve 2) koring çok hızlı gerçekleşiyor. Artan hız, numuneden büyük parçaları koparabilir ve üstün yönü toz haline getirebilir.</li>
	<li>Koring tamamlandıktan sonra, elde edilen kemik çekirdeği içi boş saplı matkap ucuna yerleşebilir (Şekil 6). Çekirdeği bitten çıkarmak için bir çift ince uçlu tokmak veya küçük bir Allen anahtarı kullanın (Şekil 2).</li>
	<li>Çekirdekli numuneyi etiketli bir mikrosantrifüj tüpünde görüntülemeye kadar serin ve kuru bir yerde saklayın.</li>
</ol>4. Kortikal kemik çekirdeklerinden kemik mikro mimarisi parametrelerini değerlendirmek için görüntü işleme rutinleri
<ol><li>μCT görüntülerinin yeniden yapılandırılması<ol>
<li>SRμCT projeksiyon görüntülerinin yeniden yapılandırılması için en son NRecon sürümünü https://www.bruker.com/products/microtomography.html indirin ve yükleyin.</li>
		<li>Masaüstünde NRecon kısayolu seçin ve ilişkili GPUReconServer görünecektir.</li>
		<li>İstediğiniz veri kümesini açılır pencerede açın. Pencere görünmüyorsa, dataviewer penceresinin sol üst köşesindeki klasör simgesini seçin.</li>
		<li>SRμCT alımından ilk projeksiyonu seçin. Çıktıaltında, Yatırım Getirisi Kullan ve ON Ölçekleseçimlerini kaldırın.</li>
		<li>Yeniden yapılandırma dosyası hedefini seçin. Gözat'ı seçin ve Keşifadlı yeni bir klasör oluşturun. Seçilen dosya biçimi BMP(8) olmalıdır.</li>
		<li>Yanlış Hizalama Telafisi 'nebakın. NOT: Bu tahmin genellikle düzeltmeye yakındır. Kaba 3D render, sağ ve sol kenarların mümkün olduğunca yakın hizalanması için üst üste binen görüntüleri kaydırmak için okları yukarı ve aşağı hareket ettirerek manuel olarak ayarlanabilir.</li>
		<li>Ayarlaraltında, Yumuşatma , Işın Sertleştirme, CS Döndürme, FOV'dan Daha Büyük Nesne ve Halka Yapı algoritmalarıuygulamak için istediğiniz seçimleri seçin. </li>
		<li>Otomatik 'i seçerek Çıktı altındaki histogramı ayarlayın. NOT: Elde eden görüntü soluk olabilir.</li>
		<li>Yeniden yapılandırmayı işlemeye başlamak için Başlat'ı seçin.</li>
		<li>Kanal/osteosit lacunar indeksleri için standart isimlendirme kullanın28. Bunlar şunları içerebilir: toplam VOI doku hacmi (TV), kanal hacmi (Ca.V), toplam kanal sayısı (Ca.N), ortalama kanal çapı (Ca.Dm), kortikal gözeneklilik (Ca.V/TV), yüzde olarak verilen, toplam lacunae sayısı (N.Lc) ve ortalama lacunar hacmi (Lc.V). Mm3 (N.Lc/BV) başına lacunar yoğunluğunu belirlemek için kemik hacmi (BV) toplam hacim eksi kanal hacmi (TV-Ca.V) olarak hesaplanır. NOT: Protokol burada duraklatılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Yeniden Yapılandırılmış Görüntülerden Mikroarşitektif Verilerin Toplanması<ol><li>Mikroarşektif parametrelerin analizi için CTAnalyser'in en son sürümünü https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html indirin ve yükleyin. NOT: CTAnalyser'ın ücretsiz sürümü işlevsellikle sınırlıdır. Bu nedenle, daha ayrıntılı analizler yapmak için tam bir lisans satın almanız önerilir.</li>
		<li>Resim | Altında Özellikler | Piksel boyutunu değiştir, piksel boyutunun uygulanan μCT görüntüleme protokolüyle eşleştiğinden emin olun. NOT: ImageJ veya benzer bir programdaki görüntüleri düzenliyorsanız, kaydettikten sonra TIFF dosyasına gömülü üstbilginin değiştirileceğini ve analiz yazılımının veri kümesini içe aktarırken piksel boyutunu değiştireceğini unutmayın.</li>
		<li>Seçin Özel İşleme görev listesi oluşturmak için (bkz. Tamamlayıcı Malzemeler) tarama veri kümesinden kemik mikro mimarisini analiz etmek için. CTAnalyser'a özel eklentileri kullanarak osteosit lacunar ağ parametreleri için genel bir protokol burada aşağıdaki gibidir: NOT: Eklenti görev listesi, örneğin FOV'da görünen tek konu olduğu veri kümeleri için iyi çalışır. Numuneyi boş alan çevrelerse, yatırım getirisi uygulanması gerekir. Aksi takdirde, 3D Analiz ve Bireysel Nesne Analizi'nde toplanan değerler yapay olarak azaltılacaktır.<ol><li>Analiz yazılımında Özel İşleme menüsünü açmadan önce görüntüleri sıfırlamak ve/veya ayarlamak için (örneğin, ImageJ veya benzeri bir düzenlemeden) yeniden yükleyin.</li>
			<li>Görüntülerdeki gürültüyü azaltmak için, yuvarlak çekirdekli ve yarıçapı 2-3 olan 3B alana Gauss düşük geçişli bir filtre uygulayın. NOT: Bu ayarlar, deneme yanılma testi yoluyla bildirilen SRμCT denemelerinden veri kümelerine uygulanmıştır. Amaç, veriler için en kaliteli rekonstrüksiyonları elde etmekti. Yeniden yapılandırma ayarlarını her benzersiz deneysel kuruluma uyacak şekilde ayarlayın.</li>
			<li>Vasküler kanalları vurgulamak için düşük ve yüksek değerler seçerek görüntülere genel gri tonlama eşik uygulayın. Şekil 8B ve 8B'de görülen yeniden yapılandırılmış dilimler 0-155 örnek eşiğini tasvir eder. NOT: 4.2.3.2 adımına benzer şekilde, burada uygulanan eşik ayarları kapsamlı deneme yanılma yoluyla seçilmiştir. Eşik, kullanılan her deneysel kurulum ve μCT görüntüleme sistemi için ayarlanmalıdır.</li>
			<li>Sadece kanalları izole etmek için osteosit lacunae'nin hacimsel piksel (voxel) boyut aralığındaki 3D alandaki beyaz lekeleri çıkarmak için despeckle (denoise). NOT: 0,9 μm piksel boyutunda alınan insan kortikal kemiğinin SRμCT taraması için osteosit lacuna için alt sınır 13 vokseldir.</li>
			<li>Kanallardaki eserleri çıkarmak için 2D alandaki siyah lekeleri çıkarmak için despeckle. Bunlar 2B olarak oldukça büyük olabilir, böylece <15.000 piksel olan özellikleri kaldırın.</li>
			<li>Kanallarda sıkışan yumuşak dokuları izole etmek için, görüntülerin kalitesine bağlı olarak 2 veya 3 yarıçaplı yuvarlak bir çekirdekle Morfolojik çalışma işlevini kullanarak gözenekleri 3D alanda genişletin.</li>
			<li>4.2.3.5 adımıyla aynı ayarları kullanarak ek bir Despeckle işlevi gerçekleştirin. kanallar içindeki izole yumuşak dokuları çıkarmak için.</li>
			<li>4.2.3.6 adımından genişlemeyi aşındırın. 2 veya 3 yarıçaplı yuvarlak bir çekirdek kullanarak Morfolojik işlem işlevini kullanma. Bu adımın yarıçapı Yordam 4.2.3.6'da kullanılan yarıçapla eşleşmelidir.</li>
			<li>3D Analiz'i çalıştırın ve damar kanallarının hacmi için hangi parametrelerin hesaplanacağını seçin. Genellikle, temel değerler yeterli bilgi sağlayacaktır.</li>
			<li>Bit eşlemleri kaydet ile işlenen görüntüleri dizindeki özel bir alt klasöre kaydedin. NOT: Amira/Avizo, Dragonfly, Drishti gibi bir program kullanarak işlenen görüntülerden 3D rekonstrüksiyon görüntüsü oluşturuyorsanız, görüntülerin tek renkli (1 bit) olarak kaydedilmeleri önerilir.</li>
			<li>Vasküler kanalların sayısını hesaplayın ve Tek Tek Nesne Analizi işlevini kullanarak boyutlarını, şekillerini ve yönelimlerini tanımlayın.</li>
			<li>4.2.3.1 – 4.2.3.3 adımlarını yineleyin. osteosit lacunar analizi için görüntüyü sıfırlamak için.</li>
			<li>Despeckle işlevini kullanarak 3D alandaki beyaz lekeleri çıkarın ve bu tür eserlerin lacunar boyutunun alt sınırından daha küçük olmasını sağlayın. Bu adım, gerçek osteosit lacunae'yi korurken, kortikal gözenekler gibi görünebilecek gürültüyü taramadan kaldırır. 0,9 μm piksel boyutunda insan SRμCT taramaları için bu alt sınır 13 vokseldir.</li>
			<li>Lacunar boyutunun üst sınırından daha büyük beyaz lekeleri çıkarmak için bir kez daha despeckle. Adım 4.2.3.13'te listelenen ayarlara sahip insan SRμCT veri kümeleri için bu sınır 2743 vokseldir.</li>
			<li>Özellikle osteosit lacuna ile ilgili mikroyapısal bilgileri ayıklamak için 3D Analiz gerçekleştirin.</li>
			<li>Osteosit lacunae'yi yalıtmak için işlenen görüntüleri kaydetmek için Bitmapleri Kaydet'i seçin.</li>
			<li>Seçilen İlgi Hacmi (VOI) içindeki osteosit sayısını 3B olarak hesaplamak için Bireysel Nesne Analizi gerçekleştirin. NOT: Görev listesi oluşturulduktan ve test edildikten sonra, CTAnalyser, veri ayıklamayı hızlandırmak ve tekdüze görüntü işlemeyi sağlamak için bunların kullanılabileceği bir toplu iş yöneticisi (BatMan) işlevine sahiptir. Yordam 4.2.3 için örnek ayarları içeren bir görev listesi. Ek Malzemeler'debulunabilir.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+the+analysis+of+bone+microstructure:+New+dimensions+in+forensic+anthropology.">Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology.</a> Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).</li><li>Wysokinski, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beamlines+of+the+biomedical+imaging+and+therapy+facility+at+the+Canadian+light+source+-+part+3.">Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source - part 3.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).</li><li>Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+variation+in+cortical+osteocyte+lacunar+parameters+in+healthy+young+males.">Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males.</a> Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).</li><li>Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femoral+osteocyte+lacunar+density,+volume+and+morphology+in+women+across+the+lifespan.">Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan.</a> Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).</li><li>Langer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-Ray+Phase+Nanotomography+Resolves+the+3D+Human+Bone+Ultrastructure.">X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure.</a> PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).</li><li>Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-+and+Nano-CT+for+the+Study+of+Bone+Ultrastructure.">Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure.</a> Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).</li><li>Dong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+osteocyte+lacunar+morphometric+properties+and+distributions+in+human+femoral+cortical+bone+using+synchrotron+radiation+micro-CT+images.">3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images.</a> Bone. 60, 172-185 (2014).</li><li>Gauthier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+micro+structural+analysis+of+human+cortical+bone+in+paired+femoral+diaphysis,+femoral+neck+and+radial+diaphysis.">3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).</li><li>Giuliani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphosphonate-related+osteonecrosis+of+the+human+jaw:+A+combined+3D+assessment+of+bone+descriptors+by+histology+and+synchrotron+radiation-based+microtomography.">Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography.</a> Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).</li><li>Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+osteon+banding+in+adult+human+cortical+bone.">Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone.</a> American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).</li><li>Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+differential+nuclear+DNA+yield+rates+and+osteocyte+numbers+among+human+bone+tissue+types:+A+synchrotron+radiation+micro-CT+approach.">Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach.</a> Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).</li><li>Britz, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+unloading+in+growing+rats+reduces+cortical+osteocyte+lacunar+density+and+volume+in+the+distal+tibia.">Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia.</a> Bone. 51 (5), 913-919 (2012).</li><li>Maggiano, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+Haversian+systems+in+human+cortical+bone+using+synchrotron+radiation-based+micro-CT:+morphology+and+quantification+of+branching+and+transverse+connections+across+age.">Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age.</a> Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).</li><li>Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgr&#237;msson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+microcomputed+tomography+imaging+of+basic+multicellular+unit-related+resorption+spaces+in+human+cortical+bone.">Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone.</a> The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).</li><li>Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+magnesite:+Rheology+of+Magnesite.">Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite.</a> Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).</li><li>Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+water+weakening+of+quartz.">Reversible water weakening of quartz.</a> Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).</li><li>Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dislocation+creep+of+polycrystalline+dolomite.">Dislocation creep of polycrystalline dolomite.</a> Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).</li><li>Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+of+orthoenstatite+single+crystals+at+mantle+pressure+and+temperature+and+comparison+with+olivine.">Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine.</a> Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).</li><li>Millard, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure+Dependence+of+Magnesite+Creep.">Pressure Dependence of Magnesite Creep.</a> Geosciences. 9 (10), 420 (2019).</li><li>Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variation+of+intracortical+porosity+in+the+midshaft+of+the+human+femur:+age+and+sex+differences.">Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences.</a> Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).</li><li>Jowsey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Changes+in+Human+Bone.">Age Changes in Human Bone.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210 (1960).</li><li>Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+skeletal+remodeling+in+aging+men.">Studies of skeletal remodeling in aging men.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).</li><li>Martin, R. B., Burr, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+implications+of+porosity+distribution+in+bone+of+the+appendicular+skeleton.">Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton.</a> Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).</li><li>Bousson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Intracortical+Porosity+in+Human+Midfemoral+Cortex+by+Age+and+Gender.">Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).</li><li>Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+microstructural+properties+of+bone+at+the+human+midshaft+femur.">Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur.</a> Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).</li><li>De Micheli, P. O., Witzel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructural+mechanical+study+of+a+transverse+osteon+under+compressive+loading:+The+role+of+fiber+reinforcement+and+explanation+of+some+geometrical+and+mechanical+microscopic+properties.">Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties.</a> Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).</li><li>Martin, R. B., Boardman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+collagen+fiber+orientation,+porosity,+density,+and+mineralization+on+bovine+cortical+bone+bending+properties.">The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties.</a> Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).</li><li>Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgr&#237;msson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+analysis+of+the+canal+network+in+cortical+bone+by+micro-computed+tomography.">Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography.</a> The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).</li><li>Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rib+histomorphometry+for+adult+age+estimation.">Rib histomorphometry for adult age estimation.</a> Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).</li><li>Pfeiffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paleohistology:+Health+and+disease.">Paleohistology: Health and disease.</a> Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).</li><li>Bone Hedges, R. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=diagenesis:+an+overview+of+processes.">diagenesis: an overview of processes.</a> Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).</li><li>. The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures Available from: <a target="_blank" href="https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf">https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf</a> (2017)</li><li>Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+formaldehyde+fixation+on+some+mechanical+properties+of+bovine+bone.">Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone.</a> Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).</li><li>Asaka, T., Kikugawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+formaldehyde+solution+on+fracture+characteristics+of+bovine+femoral+compact+bone.">Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone.</a> Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Sınırlı FOV kurulumları ile yüksek çözünürlüklü SRμCT görüntüleme için tek tip ve silindirik kortikal kemik çekirdeği örnekleri temin etmek için kapsamlı, standartlaştırılmış bir protokol olmamıştır. Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol, SRμCT görüntüleme için sürekli olarak boyutlandırılmış kortikal kemik çekirdeği örneklerinin nasıl temin edilmesi ve daha sonra mikroarctektif verilerin doğru görselleştirilmesi ve çıkarılması hakkında kapsamlı bir öğretici...

Görüntüleme teknolojisindeki son gelişmelerle birlikte, X-ışını görüntüleme verilerini çok yüksek çözünürlükte elde etmek artık mümkün. Masaüstü mikro-CT (μCT) sistemleri, tahribatsız doğası nedeniyle iptal edilen kemiği görüntüleme için geçerli standarttır1. Bununla birlikte, kortikal kemiğin mikroyapısal özelliklerinin görüntülenmesi sırasında, μCT kullanımı daha sınırlı olmuştur. Çözünürlük kısıtlamaları nedeniyle, masaüstü sistemleri osteosit lacunae gibi kortikal gözeneklerden daha küçük mikroyapısal özellikleri görüntülemek için gereken çözünürlüğe sahip olamaz. Bu uygulama için, SRμCT bu sistemlerin daha fazla çözünürlüğü nedeniyle idealdir1. Örneğin, Kanada Işık Kaynağı'nda (CLS) BiyoMedikal Görüntüleme ve Terapi (BMIT) kiriş hatları2 üzerinde yapılan deneyler, 0,9 μm kadar küçük voksellerle görüntüler üretilmiştir. Önceki çalışmalar1,3,4,5 bu çözünürlüğü, insan uzun kemiklerinden kortikal kemik örneklerinden projeksiyonlar ve sonraki üç boyutlu (3D) renderlar elde etmek için kullanmıştır ( Şekil1) osteosit lacunar yoğunluğunu ölçmek için 4,6,7,8,9 ve lacunar şekli ve boyutundaki varyasyon3 insan ömrü boyunca ve cinsiyetler arasında. Daha fazla çalışma insanlarda osteon bantlama varlığını göstermiştir10Daha önce adli antropolojik literatürde sadece insan olmayan memeliler ile ilişkili olduğu bilinen bir fenomen.
Olağanüstü çözünürlüğe ulaşmak için, X-ışını ışını, genellikle maksimum numune boyutunu birkaç milimetre çapında sınırlayan görüş alanına (FOV) ince bir şekilde odaklanmalıdır. Şu anda, literatürde bu kısıtlamaları karşılayan kemik numunesi alımını özetleyen kapsamlı, standartlaştırılmış prosedürler açıklanmamıştır. FOV içindeki örneklerin ortalanması, 1) numunenin görüntüleme sırasında 180° dönerken ortalanmış kalmasını ve 2) görüntü kesilmesi olmadığından tarama yapıtlarının sınırlı olmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Başka bir deyişle, numunenin FOV dışındaki hiçbir kısmı, FOV içindeki odak noktasına giren kirişe müdahale etmemektedir. Bu durumda, yeniden yapılandırma algoritması tam olarak doğru bir yeniden yapılandırma için gereken bazı zayıflama verilerinden mahrumdur. Ayrıca, 360 ° (tam dönüş) taramalarının ışın sertleştirme etkilerini en aza indirdiğini, ancak görüntüleme sırasında yanlış hizalama ve örnek hareketin neden olduğu eserleri artırdığını belirtmek gerekir. Bu nedenle, 360° tarama genellikle daha temiz veriler üretecek olsa da, görüntüleme süresi iki katına çıkarılır ve bu nedenle deneysel maliyet ile veri kalitesi arasındaki bir uzlaşma ele alınmalıdır.
Kemik görüntüleme deneylerinin önemli ve sıklıkla göz ardı edilen bir yönü, taramadan önce gerçekleştirilen doğru ve tekrarlanabilir numune hazırlama tekniğidir. SRμCT yöntemlerini deneylerine dahil eden çalışmalar, örnekleme protokollerinden kısaca bahseder, ancak yazarlar örneklerini toplamak için kullanılan belirli metodoloji hakkında çok az ayrıntı sağlarlar. Bu tür çalışmaların çoğu, rastgele boyutlardaki rektilinear kemik bloklarının kesilmesinden bahseder, ancak genellikle 3 , 4 , 10 , 11,12,13,14kullanılan aletler veya gömme malzemeleri hakkında daha fazla bilgi sağlamaz. Bazı araştırmacılar genellikle ilgi çekici bir bölgeden (ROI) rektilinear kemik bloklarını çıkarmak için el tipi döner aletler kullanırlar (örneğin, Dremel) 3,4,10,11,12,13,14. Bu yöntem, FOV'dan daha büyük olabilecek, tarama yapıtlarının ve görüntü kesilme olasılığını artıran, biçimsiz boyutlandırılmış örneklerle sonuçlanır. Bu tür numuneler genellikle hassas bir elmas gofret testeresi (örneğin, Buehler Isomet) kullanılarak daha fazla rafine etmeyi gerektirir. Elde edilen veri kümelerinin en yüksek kalitede olduğundan ve sonraki sonuçların yinelenebilir olduğundan emin olmak için tutarlı boyutlara sahip örneklerin (yüzde ikiye/mm' ye) tedariki önemlidir.
Numune tedarik metodolojisinin sınırlı raporlaması, önceki bir çalışmada gerçekleştirilen yöntemlerin kullanımına ve/veya doğrulandırılmaya çalışıldığında ekstra bir zorluk katmanı ekler. Şu anda, araştırmacılar örnekleme prosedürleri hakkında daha fazla bilgi için doğrudan yazarlarla iletişime geçmelidir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol, biyomedikal araştırmacılara iyice belgelenmiş, çoğaltılabilir ve uygun maliyetli bir örnekleme tekniği sağlar. Bu makalenin birincil amacı, mikroaritektif verilerin doğru görselleştirilmesi ve çıkarılması için bir freze matkap presi ve elmas coring biti kullanarak sürekli olarak boyutlandırılmış kortikal kemik çekirdeği örneklerinin nasıl temin edilmesi konusunda kapsamlı bir öğretici sağlamaktır. Bu yöntem, yüksek basınçlı kaya mekaniğindeki sert malzeme bloklarından tek tip, küçük çaplı (1-5 mm) silindirleri rutin olarak toplamak için kullanılan prosedürlerden15 , 16,17,18,19.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1367px;" width="1367">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1-1/8&#34; plunge cutting carbide for composites</td>
			<td style="width:120px;">Warrior</td>
			<td style="width:133px;">61812</td>
			<td style="width:899px;">28.6mm plunge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">BP8201500</td>
			<td>3.8 Liters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Blunt-tipped forceps</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">10-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:120px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:133px;">55398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Crystalbond 509-3 Epoxy</td>
			<td style="width:120px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:133px;">821-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CTAnalyser</td>
			<td style="width:120px;">Bruker microCT</td>
			<td style="width:133px;">v.1.15.4.0</td>
			<td>Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dental Tool Kit</td>
			<td style="width:120px;">Amazon</td>
			<td style="width:133px;">787269885110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Diamond wafering saw blade for composite material</td>
			<td style="width:120px;">Buehler</td>
			<td style="width:133px;">#11-4247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Drill Press</td>
			<td style="width:120px;">Jet Mill/Drill</td>
			<td style="width:133px;">350017</td>
			<td>Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fine-tipped forceps</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill</td>
			<td style="width:120px;">MSC Industrial Supply</td>
			<td style="width:133px;">#04804571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:120px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:133px;">26005</td>
			<td>75x50mm slides, 1mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glass slide chuck</td>
			<td style="width:120px;">Buehler</td>
			<td style="width:133px;">#112488</td>
			<td>Large enough to hold 75x50mm glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Hot plate capable of reaching 140 &#176;C</td>
			<td style="width:120px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:133px;">HP88850105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Incubator</td>
			<td style="width:120px;">NAPCO</td>
			<td>Model 4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Isocut Fluid</td>
			<td style="width:120px;">Buehler</td>
			<td style="width:133px;">111193032</td>
			<td>Lubricant; 30mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Jeweler&#39;s diamond coring drill bit</td>
			<td style="width:120px;">Otto Frei</td>
			<td style="width:133px;">#119.050</td>
			<td>2mm inner diameter hollow stem coring bit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NRecon</td>
			<td style="width:120px;">Bruker microCT</td>
			<td style="width:133px;">v.1.6.10.2</td>
			<td>Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Oscillating saw</td>
			<td style="width:120px;">Harbor Freight</td>
			<td style="width:133px;">62866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Oven-safe glass dishes</td>
			<td style="width:120px;">Pyrex</td>
			<td style="width:133px;">1117715</td>
			<td>Glass food storage container</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Precision slow-speed saw (Isomet 1000)</td>
			<td style="width:120px;">Buehler</td>
			<td style="width:133px;">111280160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Razor blades</td>
			<td style="width:120px;">Amazon</td>
			<td style="width:133px;">25181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Shallow aluminum tins</td>
			<td style="width:120px;">Amazon</td>
			<td style="width:133px;">B01MRWLD0R</td>
			<td>~8cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Specimen cups</td>
			<td style="width:120px;">Amazon</td>
			<td style="width:133px;">616784425436 885334344729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tergazyme detergent</td>
			<td style="width:120px;">Alconox</td>
			<td style="width:133px;">1304-1</td>
			<td>1.8kg box</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:120px;">MTI Corporation</td>
			<td style="width:133px;">KJ201508006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sectioning, coring, and image processing guide for high-throughput cortical bone sample procurement and analysis for synchrotron micro-ct

Kemik, insan ömrü boyunca yapısı değişen dinamik ve mekanik olarak aktif bir dokudur. Kemik remodeling işleminin ürünleri geleneksel iki boyutlu teknikler kullanılarak önemli ölçüde incelenmiştir. Masaüstü mikro bilgisayarlı tomografi (μCT) ve senkrotron radyasyon mikro bilgisayarlı tomografi (SRμCT) aracılığıyla X-ışını görüntüleme teknolojisindeki son gelişmeler, insan kortikal kemiği içindeki mikroskobik yapıların daha eksiksiz bir resmini sağlayan diğer 3D görüntüleme tekniklerine (örneğin, SEM) göre daha geniş bir görüş alanının (FOV) yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) taramalarının elde edilmesine izin verdi. Bununla birlikte, örnek, veri analizini etkilediği bilinen çizgi yapıtlarının görünümünü sınırlamak için FOV içinde doğru bir şekilde ortalanmalıdır. Önceki çalışmalar, düzensiz şekilli rektilineer kemik bloklarının tedarikinin, düzensiz kenarlar veya görüntü kesilmesi nedeniyle görüntüleme yapıtlarıyla sonuç olduğunu bildirmiştir. SRμCT deneyleri için insan femorasının ön yönünden sürekli boyutlu kortikal kemik çekirdeği örnekleri temin etmek için jeolojik örnekleme protokolü (koring) uyguladık. Bu koring yöntemi verimli ve doku için minimal yıkıcıdır. Dönme sırasında izometrik olması ve tarama boyunca X-ışını ışınları için düzgün bir yol uzunluğu sağlaması nedeniyle görüntüleme yapıtlarını azaltan tekdüze silindirik örnekler oluşturur. Özlü ve düzensiz şekilli örneklerin X-ışını tomografik verilerinin görüntü işlemesi, kortikal kemik mikro mimarisinin görselleştirilmesini ve analizini iyileştirme tekniğinin potansiyelini doğrulamamaktadır. Bu protokolün bir amacı, çeşitli yüksek çözünürlüklü kemik görüntüleme deneyleri için uyarlanabilen kortikal kemik çekirdeklerinin çıkarılması için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktır. Çalışmanın kapsamlı bir amacı, SRμCT için uygun fiyatlı, tutarlı ve basit standartlaştırılmış bir kortikal kemik tedariki oluşturmaktır. Bu prosedür, biyolojik antropoloji, yerbilimleri veya malzeme bilimleri gibi sert kompozit malzemeleri yaygın olarak değerlendiren ilgili alanlardaki araştırmacılar tarafından daha da uyarlanabilir.

Açıklanan çekirdek örnekleme yönteminin son derece etkili ve verimli olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokolü kullanan korse numuneleri, CLS BMIT-BM kiriş hattı 2 üzerindeki deneyler için 1,49 μm voksel boyutunda~2mm FOV ile >300 sürekli boyutlu numunelerin tedarikine izin verdi. Çekirdek çapının tutarlılığını doğrulamak için, insan ön femoral çekirdeklerinin bir alt kümesinin uzunluğu (üst, orta, alt) boyunca üç ölçüm yapıldı (n=69). Çekirdeklerin orta...

Watch this Scientific Journal Video about A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT at JoVE.com

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

İnsan femorasının ön yönünden SRμCT deneyleri için tek tip boyutta kortikal kemik örnekleri temin etmek için jeolojik (koring) örnekleme protokolü yaptık. Bu yöntem minimal yıkıcı, verimlidir, düzensiz örnek şekillerinden görüntüleme yapıtlarını en aza indiren ve mikroarşitektif görselleştirme ve analizi geliştiren silindirik örneklerle sonuçlanır.

Synchrotron Micro-CT için Yüksek Verimli Kortikal Kemik Örneği Alımı ve Analizi için Kesitleme, Coring ve Görüntü İşleme Kılavuzu

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

a-sectioning-coring-image-processing-guide-for-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biology

5.0K Görüntüleme.  The University of Akron. İnsan femorasının ön yönünden SRμCT deneyleri için tek tip boyutta kortikal kemik örnekleri temin etmek için jeolojik (koring) örnekleme protokolü yaptık. Bu yöntem minimal yıkıcı, verimlidir, düzensiz örnek şekillerinden görüntüleme yapıtlarını en aza indiren ve mikroarşitektif görselleştirme ve analizi geliştiren silindirik örneklerle sonuçlanır.

Video: A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel production 1. Chemical methods to modify or degrade cellulose typically require strong acids and high temperatures. As such, enzymatic methods have become prominent in the bioconversion process. While the identification of active cellulases from bacterial and fungal isolates has been somewhat effective, the vast majority of microbes in nature resist laboratory cultivation. Environmental genomic, also known as metagenomic, screening approaches have great promise in bridging the cultivation gap in the search for novel bioconversion enzymes. Metagenomic screening approaches have successfully recovered novel cellulases from environments as varied as soils 2, buffalo rumen 3 and the termite hind-gut 4 using carboxymethylcellulose (CMC) agar plates stained with congo red dye (based on the method of Teather and Wood 5). However, the CMC method is limited in throughput, is not quantitative and manifests a low signal to noise ratio 6. Other methods have been reported 7,8 but each use an agar plate-based assay, which is undesirable for high-throughput screening of large insert genomic libraries. Here we present a solution-based screen for cellulase activity using a chromogenic dinitrophenol (DNP)-cellobioside substrate 9. Our library was cloned into the pCC1 copy control fosmid to increase assay sensitivity through copy number induction 10. The method uses one-pot chemistry in 384-well microplates with the final readout provided as an absorbance measurement. This readout is quantitative, sensitive and automated with a throughput of up to 100X 384-well plates per day using a liquid handler and plate reader with attached stacking system.

This protocol describes a high throughput screen for cellulolytic activity from a metagenomic library expressed in Escherichia coli. The screen is solution based and highly automated, and uses one-pot chemistry in 384 well microplates with the final readout as an absorbance measurement.

Yüksek Verimli Ekran Metagenomic Kütüphaneler selülaz Aktivitesi Biomining

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

Biyoloji

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface ('rough eye' phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.1). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.
The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. 2). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells ('hexagon' around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six "outer" (R1-6) and two "inner" photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. 3).
The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready4. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined5,6.

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A standard approach to prepare adult Drosophila eyes for semi-thin sectioning and light microscopic analysis is presented here. The protocol can be used for gross morphological analysis of eye defects, or with the indicated adjustments can be used to determine genetic requirements of genes in specific cell types of the eye (e.g. clonal analysis of photoreceptors) or for electron microscopic analysis.

Yetişkin hazırlanması Drosophila Gözler İnce Kesit ve Mikroskobik Analizi

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

Nonexperts için Phylogenetics İçin Pratik Kılavuz

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

Tümör sferoidlerin Yüksek throughput Görüntü Analizi: Otomatik ve Doğru küremsiler boyutunu ölçmek için kullanıcı-dostu Yazılım Uygulama

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Yüksek verim Uygulamaları Yetişkin Zebra Hearts Kurtarma

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

Yüksek Verim, Mineralize Dokuların Çoklu Resim Cryohistology

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...