Bu protokolü geliştirmek için yapılan çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir [AR072609].

Kemik Kırığı Duyarlılığı için Mekanik Test Prensipleri ve Protokolleri

<ol>
	<li>Vesper, E. O., Hammond, M. A., Allen, M. R., Wallace, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+with+rehydration,+preservation+in+ethanol+influences+the+mechanical+properties+of+bone+and+how+bone+responds+to+experimental+manipulation.">Even with rehydration, preservation in ethanol influences the mechanical properties of bone and how bone responds to experimental manipulation.</a> Bone. 97, 49-53 (2017).</li><li>Jepsen, K. J., Silva, M. J., Vashishth, D., Guo, X. E., van der Meulen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+biomechanical+mechanisms+in+mouse+models:+practical+guidelines+for+systematically+evaluating+phenotypic+changes+in+the+diaphyses+of+long+bones.">Establishing biomechanical mechanisms in mouse models: practical guidelines for systematically evaluating phenotypic changes in the diaphyses of long bones.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (6), 951-966 (2015).</li><li>Eds Burr, D. B., Allen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic and Applied Bone Biology. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> microCT SkyScan 1272 User Manual. , (2018).</li><li>Kim, Y., Brodt, M. D., Tang, S. Y., Silva, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+scanning+and+analysis+of+mouse+bones.">MicroCT for scanning and analysis of mouse bones.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, 169-198 (2021).</li><li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography.">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Micro-CT specimen scanner, Centre for high-throughput phenogenomics. , (2023).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard test method for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials by four-point bending. , (2020).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard test methods for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruker+microCT+NRecon:+An+overview.">Bruker microCT NRecon: An overview.</a> , (2023).</li></ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Tarama ve test süreci boyunca, sorun giderme ve optimizasyonun uygun olduğu anlar vardır. Bunlardan ilki, μCT kullanarak kemikleri tararken ortaya çıkar. Birçok sistem, bir nesnenin tutulabileceği ve taranabileceği bir tutucu ile birlikte gelirken, aynı anda birden fazla kemiği taramak için özel tutucular üretilebilir. Birden fazla kemiğin taranması optimizasyon için mükemmel bir nokta olabilir, ancak artefaktların indüklenmediğinden emin olmak için tarama ve analiz süreci boyunca dikkatli olunmal?...

Kemiğin mekanik testi, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığı ile ilgili fonksiyonel bilgileri çıkarmak için birincil yöntemdir. Klinik öncesi çalışmalarda, çeşitli test yöntemleri kullanılabilir, ancak en yaygın olanı uzun kemiklerin bükülmesidir. Bu testlerin gerçekleştirilmesi kolaydır ve insandan fareye kadar değişen boyutlarda kemikler üzerinde kullanılabilir. Fareler, klinik öncesi araştırmalarda en sık çalışılan hayvanlardan biri olduğundan, bu protokol, farelerin femora ve tibiaları üzerinde yapılan bükme testlerine odaklanacaktır.
Bükme testleri yapılmadan önce kemikler uygun şekilde alınmalı ve saklanmalıdır. En yaygın saklama yöntemleri geleneksel olarak kemiklerin tuzlu suya batırılmış gazlı bezde dondurulması, tek başına tuzlu suda dondurulması veya kemiklerin etanol 1 içinde kurutulması olmuştur. Etanolde depolanan kemiklerin, donmuş olarak depolananlara kıyasla sertlik ve elastik modülün arttığı ve deformasyon parametrelerinin azaldığı gösterilmiştir1. Testten önce kemikleri yeniden sulandırmak bile bu özellikleri normal seviyelere geri getirmez 1. Tuzlu suya batırılmış olarak depolamak, salin genişledikçe basınç uygulandığından kemiğe zarar verebilir. Ek olarak, mikrobilgisayarlı tomografi (μCT) taraması için kemikleri çıkarmak için çözeltinin tamamen çözülmesi gerekecektir. Sonuç olarak, taze hasat edilmiş kemiklerin tuzlu suya batırılmış gazlı bezde dondurulması standart saklama yöntemi haline gelmiştir ve bu protokol boyunca tavsiye edilir.
Bir kemiğin büyüklüğü ve şekli kütle kuvvetini etkilediğinden ve birçok hastalık modeli kemik boyutunu ve morfolojisini önemli ölçüde değiştirdiğinden, dokunun davranışını tahmin eden özellikler üretmek için boyutun etkilerini normalleştirmek için mühendislik ilkeleri kullanılır2. Bu yaklaşım, testten önce kemiklerin taramalarını oluşturmak için en yaygın olarak μCT kullanılarak elde edilen başarısızlık yerinin enine kesit geometrisini gerektirir. μCT, kullanılabilirliği ve yüksek görüntü çözünürlüğü nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, yumuşak dokunun katkıları dahil değildir ve tarama, kemiğe kimyasal fiksasyon veya başka değişiklikler gerektirmez 3,4. Tüm CT formlarında, bir X-ışını kaynağı bir nesneye odaklanırken, nesnenin diğer tarafındaki bir dedektör ortaya çıkan X-ışını enerjisini ölçer. Bu, numunenin bir görüntüyedönüştürülebilen bir X-ışını gölgesi üretir 3,5. Taranan nesne döndürülür (veya X-ışını kaynağı ve dedektör numunenin etrafında döndürülür), nesneyi temsil eden üç boyutlu bir veri setine yeniden oluşturulabilen görüntüler üretilir5.
Tarama çözünürlüğü veya iki nesnenin birbirine ne kadar yakın olabileceği ve yine de ayrı ayrı çözümlenebileceği, elde edilen görüntüdeki nominal voksel boyutu veya bir pikselin boyutu değiştirilerek kontrol edilir. Genel olarak, nesnelerin tanımlanması için tek bir vokselin en az iki katı büyüklüğünde olması gerektiğikabul edilir 3, ancak daha yüksek bir oran daha fazla hassasiyet sağlayacaktır. Ayrıca, daha büyük vokseller kısmi hacim etkilerine daha yatkındır: tek bir voksel farklı yoğunluklarda dokular içerdiğinde, tek bir dokunun özgül yoğunluğundan ziyade bu yoğunlukların ortalamasına atanır, bu da doku alanlarının ve mineral yoğunluğunun fazla veya eksik tahmin edilmesine yol açabilir3. Bu sorunlar daha küçük voksel boyutları seçilerek hafifletilebilse de, daha yüksek bir çözünürlük kullanmak kısmi hacim etkilerinin ortadan kaldırılmasını sağlamaz ve daha uzun tarama süreleri gerektirebilir3. Kemikleri ex vivo olarak tararken, fare kemiklerinin trabeküler mimarisini doğru bir şekilde değerlendirmek için genellikle 6-10 μm'lik bir voksel boyutu önerilir. Kortikal kemik için 10-17 μm'lik daha büyük bir voksel boyutu kullanılabilir, ancak en küçük makul voksel boyutu kullanılmalıdır. Bu protokol, temel trabeküler özellikleri ayırt etmek ve kapsamlı tarama süresi olmadan kısmi hacim etkilerini en aza indirmek için yeterince küçük olan 10 μm'lik bir voksel boyutu kullanır.
Kemik dokusunun yüksek mineral yoğunluğu ve kalınlığı, iletilen X-ışını enerji spektrumunu büyük ölçüde zayıflattığı ve değiştirdiği için X-ışını enerjisi ve enerji filtresi ayarları da dikkatli bir şekilde seçilmelidir. Genel olarak, yayılan X-ışını spektrumunun nesne6'dan çıkan spektruma eşdeğer olduğu için, kemik gibi yoğun nesneler üzerinde düşük enerjili X-ışınlarının kullanılmasının, ışın sertleşmesi7 olarak bilinen bir artefakta yol açabileceği varsayılır. Bu artefaktların insidansını azaltmak için kemik örneklerini tararken 50-70 kVp'lik daha yüksek bir voltaj önerilir5. Ek olarak, bir alüminyum veya bakır enerji filtresinin takılması, daha konsantre bir enerji ışını oluşturarak artefaktları daha da en aza indirir 4,7. Bu protokol boyunca 0,5 mm alüminyum filtre kullanılacaktır.
Son olarak, tarama döndürme adımı ve döndürme uzunluğu (örneğin, 180°-360°), son taramadaki gürültü miktarını belirleyenyakalanan görüntü sayısını birlikte kontrol eder 4. Her adımda birden fazla karenin ortalamasını almak gürültüyü azaltabilir ancak tarama süresini artırabilir4. Bu protokol, 0,7 derecelik bir döndürme adımı ve 2 derecelik bir çerçeve ortalaması kullanır.
Tarama hakkında son bir not: hidroksiapatit kalibrasyon fantomları, zayıflama katsayılarının g/cm35 cinsinden mineral yoğunluğuna dönüştürülmesini sağlamak için deneysel kemiklerle aynı tarama ayarları kullanılarak taranmalıdır. Bu protokol, farklı fantomlar mevcut olmasına rağmen, 0.25 g/cm3 ve 0.75 g/cm3 hidroksiapatit fantomları kullanır. Bazı tarama sistemlerinin, günlük sistem kalibrasyonunun bir parçası olarak dahili fantomlar kullandığını unutmayın.
Tarama tamamlandıktan sonra, açısal çıkıntılar, tipik olarak üreticinin eşlik eden yazılımı kullanılarak nesnenin kesit görüntülerine dönüştürülür. Hangi sistem kullanılırsa kullanılsın, rekonstrüksiyonda tüm kemiğin yakalandığından ve eşiğin kemik ile kemik olmayanın tanınmasına izin verecek şekilde uygun şekilde ayarlandığından emin olmak önemlidir. Rekonstrüksiyondan sonra, tüm taramaları üç boyutlu olarak döndürmek çok önemlidir, böylece kemikler yine üreticinin yazılımını kullanarak enine eksenle tutarlı ve düzgün bir şekilde hizalanır.
Rotasyonu takiben, mekanik normalizasyon için kortikal özellikler, trabeküler özellikler veya kırılma geometrisinin istenip istenmediğine bağlı olarak analiz için ilgi alanları (ROI) seçilebilir. İkincisi için, kırık bölgesinden kemiğin bir ucuna olan mesafeyi ölçerek ve tarama dosyasında karşılık gelen dilim konumunu belirlemek için voksel boyutu kullanılarak test edildikten sonra ROI'ler seçilmelidir. Seçilen bölge en az 100 μm uzunluğunda olmalı ve kırılma noktası ROI'nin yaklaşık merkezinde olmalıdır4.
ROI'ler seçildiğinde, mekanik normalizasyon için iki özellik gereklidir (eğilme gerilimini ve gerinimini hesaplamak için): nötr eğilme ekseninden arızanın başlatıldığı yüzeye olan maksimum mesafe (test kurulumu tarafından belirlenen, gerilimde yüklü yüzey olduğu varsayılır) ve nötr eksen etrafındaki atalet momenti alanı (ayrıca test kurulumuna bağlıdır). Bu protokol, bu değerleri belirlemek için özel bir kod kullanılmasını önerir. Koda erişmek için doğrudan ilgili yazarla iletişime geçin veya daha fazla bilgi için https://bbml.et.iupui.edu/ adresindeki laboratuvar web sitesini ziyaret edin.
μCT taraması tamamlandıktan sonra mekanik test başlayabilir. Bükme testleri, dört noktalı veya üç noktalı konfigürasyonlarda gerçekleştirilebilir. Dört noktalı eğilme testleri, yükleme noktaları arasındaki kemikteki kayma gerilmesini ortadan kaldırdığı ve bu bölgede saf eğilmenin gerçekleşmesine olanak sağladığı için tercih edilmektedir3. Kemik daha sonra gerginlik nedeniyle kırılacak ve kemiğin gerçek bükülme özelliklerini daha iyi temsil eden bir başarısızlık yaratacaktır3. Bununla birlikte, kemik, her iki yükleme noktasında da aynı yükü verecek şekilde yüklenmelidir (bu, döner bir yükleme kafası ile kolaylaştırılabilir). Üç nokta eğilme testlerinde, yük noktasının kemikle birleştiği yerde kayma gerilmesinde büyük bir değişiklik olur ve bu da kemiğin bu noktada gerilme3 değil kayma nedeniyle kırılmasına neden olur. ASTM standartları, bükülmeye maruz kalan malzemelerin uzunluk-genişlik oranının 16:1 olmasını önermektedir,yani kesme 8,9 etkilerini en aza indirmek için destek açıklığının uzunluğu kemiğin genişliğinden 16 kat daha büyük olmalıdır. Küçük kemirgen kemiklerini test ederken bunu başarmak genellikle imkansızdır, bu nedenle yükleme aralığı mümkün olduğunca büyük, ancak enine kesit şeklinde mümkün olduğunca küçük bir değişiklikle yapılır. Ayrıca, dört noktalı bükme yapılırken, alt ve üst açıklığın uzunlukları arasındaki oran ~3:18 olmalıdır, bu genellikle tibiada elde edilebilir, ancak daha kısa femurda zordur. Ek olarak, femurların daha ince kortikal duvarları, onları test sırasında kemik kesitinin şeklini değiştiren halka tipi deformasyona duyarlı hale getirir (bu, üç noktalı bükülmeye kıyasla aynı bükülme momentini indüklemek için daha büyük bir kuvvet gerektiğinden dört noktalı testlerde vurgulanabilir). Bu nedenle, bu protokol boyunca fare femora için üç noktalı bükme kullanılırken, tibia için dört noktalı bükme kullanılacaktır.
Son olarak, istatistiksel analiz için çalışmayı uygun şekilde güçlendirmek önemlidir. Mekanik testler için genel bir öneri, bazı mekanik özellikler, özellikle akma sonrası parametreler oldukça değişken olabileceğinden, farklılıkları tespit edebilmek için deney grubu başına 10-12 kemiklik bir örneklem büyüklüğüne sahip olmaktır. Bazı durumlarda, bu, çalışma sırasında meydana gelebilecek yıpranma göz önüne alındığında daha yüksek bir hayvan örneklem büyüklüğü ile başlamak anlamına gelebilir. Bir çalışmaya başlamadan önce mevcut veriler kullanılarak örneklem büyüklüğü analizi tamamlanmalıdır.
Çok sayıda sınırlama ve varsayım vardır, ancak bükme testleri, özellikle gruplar arasındaki göreceli farklılıklar söz konusu olduğunda oldukça doğru sonuçlar verebilir. Bu özellikler, trabeküler mimari ve kortikal morfolojinin analizi ile birlikte, hastalık durumları ve tedavi rejimleri hakkında daha iyi bilgi sağlayabilir. Deneyin kontrolümüzde olan yönlerine (örneğin, hasat, depolama, tarama ve test etme) dikkat edilirse, doğru sonuçların üretildiğinden emin olabiliriz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAn</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataViewer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Rotation Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td>Coding platform used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRecon</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software&#160;&#160;</td>
			<td>Micro Photonics Inc</td>
			<td>SKY-016814</td>
			<td>Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical considerations for the design, execution, and interpretation of studies involving whole-bone bending tests of rodent bones

Kırılmaya yol açan iskelet kırılganlığı, her yıl 1,5 milyon kırık ve 18 milyar dolarlık doğrudan bakım maliyeti ile sonuçlanan bir Amerikan halk sağlığı krizidir. Kemik hastalığının altında yatan mekanizmaları ve tedaviye yanıtı anlama yeteneği sadece arzu edilen değil, aynı zamanda kritiktir. Kemiğin mekanik testi, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığını anlamak ve ölçmek için değerli bir teknik olarak hizmet eder. Bu yöntemin gerçekleştirilmesi basit görünse de, geçerli varsayımlar ve temel adımlar kullanıcı tarafından göz ardı edilirse uygunsuz ve yanlış sonuçlara varılabilir. Bu, yöntemlerin yanlış kullanımı ve sonuçların yanlış yorumlanması ile çalışmalar yayınlanmaya devam ettikçe disiplinler arasında gözlemlenmiştir. Bu protokol, mekanik testlerle ilgili ilkeler ve bu tekniklerin uygulanmasıyla birlikte - numune boyutunun dikkate alınmasından doku toplama ve depolamaya, veri analizi ve yorumlanmasına kadar - için bir astar görevi görecektir. Bununla birlikte, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığı ile ilgili değerli bilgiler elde edilebilir ve hem akademik araştırmalar hem de klinik çözümler için daha iyi anlaşılabilir.

Mechanical testing of bone is the primary method to extract functional information related to a bone&#39;s susceptibility to fracture. In preclinical studies, several testing modalities can be used but by far the most common is the bending of long bones. These tests are easy to perform and can be used on bones ranging in size from human to mouse. As mice are one of the most commonly studied animals in preclinical research, this protocol will focus on bending tests performed on the femora and tibiae of mice.
Prior to performing bending tests, bones must be properly harvested and stored. The most common storage methods have traditionally been freezing bones in saline-soaked gauze, freezing in saline alone, or dehydrating bones in ethanol 1. Bones stored in ethanol have been shown to have increased stiffness and elastic modulus and decreased deformation parameters versus those stored frozen1. Even rehydrating the bones prior to testing does not recover these properties back to normal levels 1. Storing submerged in saline could cause damage to the bone since pressure is exerted as the saline expands. In addition, a complete thaw of the solution would be required to remove the bones for microcomputed tomography (&#181;CT) scanning. Consequently, freezing freshly harvested bones in saline-soaked gauze has become the standard storage method and is recommended throughout this protocol.
Because the size and shape of a bone affect its bulk strength and many disease models significantly alter bone size and morphology, engineering principles are used to normalize away the effects of size to produce properties that estimate the behavior of the tissue2. This approach requires cross-sectional geometry of the failure location, which is most commonly acquired using &#181;CT to create scans of the bones prior to testing. &#181;CT is widely used due to its availability and high image resolution. Moreover, contributions of soft tissue are not included, and scanning does not require chemical fixation or other modifications to the bone3,4. In all forms of CT, an X-ray source is focused on an object while a detector on the other side of the object measures the resulting X-ray energy. This produces an X-ray shadow of the sample that can be converted into an image3,5. The object being scanned is rotated (or the X-ray source and detector are rotated around the sample), generating images that can be reconstructed into a three-dimensional data set representing the object5.
Scan resolution, or how close together two objects can be and still be resolved individually, is controlled by changing the nominal voxel size or the size of a pixel in the resulting image. It is generally accepted that objects must be at least two times the size of a single voxel to be identified3, but a higher ratio will allow for improved precision. Further, larger voxels are more prone to partial volume effects: when a single voxel contains tissues of varying densities, it is assigned the average of these densities, rather than the specific density of a single tissue, which may lead to an over- or under-estimation of tissue areas and mineral density3. While these issues can be mitigated by choosing smaller voxel sizes, using a higher resolution does not ensure the elimination of partial volume effects and may require longer scan times3. When scanning bones ex vivo, a voxel size of 6-10 &#181;m is generally recommended to accurately assess the trabecular architecture of mouse bones. A larger voxel size of 10-17 &#181;m can be used for cortical bone, although the smallest reasonable voxel size should be used. This protocol uses a 10 &#181;m voxel size, which is small enough to differentiate key trabecular properties and minimize partial volume effects without extensive scan time.
X-ray energy and energy filter settings must also be selected carefully, as the high mineral density and thickness of bone tissue greatly attenuates and alters the transmitted X-ray energy spectrum. It is generally assumed that because the emitted X-ray spectrum is equivalent to the spectrum that exits the object6, using low-energy X-rays on dense objects such as bone can lead to an artifact known as beam hardening7. A higher voltage of 50-70 kVp is recommended when scanning bone samples to reduce the incidence of these artifacts5. In addition, inserting an aluminum or copper energy filter creates a more concentrated energy beam, further minimizing artifacts4,7. A 0.5 mm aluminum filter will be used throughout this protocol.
Finally, the scan rotation step and rotation length (e.g., 180&#176;-360&#176;), together control the number of images captured, which determines the amount of noise in the final scan4. Averaging multiple frames in each step can reduce noise but may increase scan time4. This protocol uses a rotation step of 0.7 degrees and a frame averaging of 2.
One final note about scanning: hydroxyapatite calibration phantoms should be scanned using the same scan settings as the experimental bones to enable the conversion of attenuation coefficients to mineral density in g/cm35. This protocol uses phantoms of 0.25 g/cm3 and 0.75 g/cm3 of hydroxyapatite, although different phantoms are available. Note that some scanning systems use internal phantoms as part of daily system calibration.
Once scanning is complete, the angular projections are reconstructed into cross-sectional images of the object, typically using the manufacturer&#39;s accompanying software. Whatever system is used, it is important to ensure that the whole bone is captured in the reconstruction and that thresholding is set appropriately to allow for the recognition of bone versus non-bone. After reconstruction, it is critical to rotate all scans in three dimensions so that bones are oriented consistently and properly aligned with the transverse axis, again using the manufacturer&#39;s software.
Following rotation, regions of interest (ROI) for analysis may be selected based on whether cortical properties, trabecular properties, or fracture geometry for mechanical normalization are desired. For the latter, ROIs should be selected after testing by measuring the distance from the fracture site to one end of the bone and using voxel size to determine the corresponding slice location in the scan file. The selected region should be at least 100 &#181;m in length, with the fracture point at the approximate center of the ROI, to provide adequate estimation4.
With ROIs selected, two properties are needed for mechanical normalization (to calculate bending stress and strain): the maximum distance from the neutral bending axis to the surface where failure is initiated (assumed to be the surface loaded in tension, determined by the testing setup), and the area moment of inertia around the neutral axis, (also dependent on testing setup). This protocol recommends the use of a custom code to determine these values. For access to the code, contact the corresponding author directly or visit the lab website at&#160;https://bbml.et.iupui.edu/ for more information.
Once &#181;CT scanning has been completed, mechanical testing can begin. Bending tests can be performed in either four-point or three-point configurations. Four-point bending tests are preferred as they eliminate shear stress in the bone between loading points, allowing for pure bending to occur in this region3. The bone will then fracture due to tension, creating a failure that is more representative of the true bending properties of the bone3. However, the bone must be loaded in such a way as to deliver the same load at both loading points (this can be facilitated with a pivoting loading head). In three-point bending tests, there is a large change in shear stress where the load point meets the bone, which causes the bone to break at this point due to shear, not tension3. ASTM standards recommend materials undergoing bending should have a length-to-width ratio of 16:1, meaning the length of the support span should be 16 times larger than the width of the bone to minimize impacts of shear8,9. This is often impossible to achieve when testing small rodent bones, so the loading span is simply made as large as possible but with as small of a change in cross-sectional shape as possible. Moreover, when performing four-point bending, the ratio between the lengths of the lower and upper span should be ~3:18, which can usually be achieved in the tibia, but it is difficult in the shorter femur. In addition, the thinner cortical walls of femurs make them susceptible to ring-type deformation which changes the shape of the bone cross-section during the test (this can be accentuated in four-point tests as a greater force is required to induce the same bending moment compared to three-point bending). Therefore, three-point bending will be utilized for mouse femora while four-point bending will be used for tibiae throughout this protocol.
Finally, it is important to properly power the study for statistical analysis. A general recommendation for mechanical testing is to have a sample size of 10-12 bones per experimental group to be able to detect differences, as some mechanical properties, especially postyield parameters, can be highly variable. In some cases, this may mean starting with a higher animal sample size given attrition that could occur during the study. Sample size analysis using existing data should be completed prior to attempting a study.
There are numerous limitations and assumptions, but bending tests can provide quite accurate results, especially when relative differences between groups are of interest. These properties, together with the analysis of trabecular architecture and cortical morphology, can provide better insight into disease states and treatment regimens. If care is taken with those aspects of the experiment that are in our control (e.g., harvesting, storing, scanning, and testing), we can feel confident that accurate results have been generated.

Yazar Spotlight: Tüm Kemik Bükme Testlerinde Doğruluğu ve Tekrarlanabilirliği Artırma 

Kemirgen kemiklerinin tüm kemik bükme testlerini içeren çalışmaların tasarımı, yürütülmesi ve yorumlanması için pratik hususlar

The current experimental challenges of bending tests include:Consistent placing of the bones in the same orientation, documenting the break progress of the bone during the test, and interpretation of complex results. Our protocol provides a guide not only for the testing procedure and data analysis for whole-bone bending tests, but also for sample preparation and storage. And this is the first instance where the entire protocol has been presented.Whole-bone mechanical testing is a quick and simple method to obtain measures of bone fracture susceptibility when compared to other testing methods.

BT taramasının tamamlanmasının ardından, yetersiz taramaların çoğu rekonstrüksiyonda yakalanabilir. Genellikle, zayıf taramalar, tarama sırasındaki bir hatanın açık bir göstergesi olan yüksek bir yanlış hizalama telafisine sahip olacaktır. Ancak, diğer adımlarda hatalar oluşabilir ve yanlış verilere de yol açabilir. Bu hatalar genellikle tek tek hesaplanan mimari özellikler incelenirken fark edilebilir. Değerler bir gruptaki diğer değerlerin aralığının çok dışında kalıyorsa, tarama,...

Watch this Scientific Journal Video about Enhancing Accuracy and Reproducibility in Whole Bone Bending Tests at JoVE.com

Kemirgen kemiklerinin mekanik testi, bir kemiğin kırılmaya yatkınlığı ile ilgili bilgileri çıkarmak için değerli bir yöntemdir. Uygun pratik anlayıştan yoksun olarak, sonuçlar aşırı yorumlanabilir veya geçerlilikten yoksun olabilir. Bu protokol, geçerli ve işlevsel veriler sağlamak için mekanik testlerin doğru bir şekilde yapılmasını sağlamak için bir kılavuz görevi görecektir.

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care ...

Bükme testlerinin mevcut deneysel zorlukları şunları içerir: Kemiklerin aynı yönde tutarlı bir şekilde yerleştirilmesi, test sırasında kemiğin kırılma ilerlemesinin belgelenmesi ve karmaşık sonuçların yorumlanması. Protokolümüz, yalnızca tüm kemik bükme testleri için test prosedürü ve veri analizi için değil, aynı zamanda numune hazırlama ve saklama için de bir kılavuz sağlar. Ve bu, tüm protokolün sunulduğu ilk örnektir.Tüm kemik mekanik testi, diğer test yöntemleriyle karşılaştırıldığında kemik kırığı duyarlılığını ölçmek için hızlı ve basit bir yöntemdir.

practical-considerations-for-design-execution-interpretation-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Practical Considerations for the Design, Execution, and Interpretation of Studies Involving Whole-Bone Bending Tests of Rodent Bones

581 Görüntüleme.  Indiana University-Purdue University Indianapolis. Bükme testlerinin mevcut deneysel zorlukları şunları içerir: Kemiklerin aynı yönde tutarlı bir şekilde yerleştirilmesi, test sırasında kemiğin kırılma ilerlemesinin belgelenmesi ve karmaşık sonuçların yorumlanması. Protokolümüz, yalnızca tüm kemik bükme testleri için test prosedürü ve veri analizi için değil, aynı zamanda numune hazırlama ve saklama için de bir kılavuz sağlar. Ve bu, tüm protokolün sunulduğu ilk örnektir.Tüm kemik mekanik testi, ...

Video: Yazar Spotlight: Tüm Kemik Bükme Testlerinde Doğruluğu ve Tekrarlanabilirliği Artırma 

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care costs. The ability to understand the mechanisms underlying bone disease and the response to treatment is not only desired, but critical. Mechanical testing of bone serves as a valuable technique for understanding and quantifying a bone&#39;s susceptibility to fracture. While this method appears simple to perform, inappropriate and inaccurate conclusions may be reached if governing assumptions and key steps are disregarded by the user. This has been observed across disciplines as studies continue to be published with misuse of methods and incorrect interpretation of results. This protocol will serve as a primer for the principles associated with mechanical testing along with the application of these techniques-from considerations of sample size through tissue harvesting and storage, to data analysis and interpretation. With this in hand, valuable information regarding a bone&#39;s susceptibility to fracture may be obtained, furthering understanding for both academic research and clinical solutions.

Mechanical testing of rodent bones is a valuable method for extracting information regarding a bone's susceptibility to fracture. Lacking proper practical understanding, the results may be overinterpreted or lack validity. This protocol will serve as a guide to ensure mechanical tests are performed accurately to provide valid and functional data.

Biyomühendislik

Mechanical Testing Procedure to Check Bone&#39;s Susceptibility to Fracture

Mechanical Testing Procedure to Check Bone&#039;s Susceptibility to Fracture  

After harvesting the femur and tibia from the euthanized mouse, obtain a six to 10 micrometer resolution micro CT scan reconstructed for each sample to calculate for exercise geometry. Thaw all the bones for testing, and ensure to test all bones from the same experiment in one session. Now locate a load cell with sensitivity and capacity suitable for the specimen.Considering the failure range of the specimen, select a load cell with 50%more capacity while maximizing sensitivity. Locate the loading and support span fixtures. Install the load cell and fixtures by screwing the load cell onto the upper support of the tester, attaching the upper loading fixture to the load cell and mounting the lower fixture to the bottom support of the tester.Then select a support span length, which will remain constant for all samples. Use the shortest bone in the sample set to determine the support span distance, and properly orient the bone between the fixtures. To perform a three-point bending test of the femur.place the anterior surface of the bone against the support span, ensuring the position is within the diaphysis of the sample. Exclude the third trochanter on the proximal end and the transition point where the bone widens into the metaphysis and condyles on the distal end. Ensure the loading span is centered within the support span and contains a uniform region of the bone.Then measure and record the support span distance. Once the support span has been set and recorded, bring the lower fixture close to the upper fixture with enough room between the two for a bone to be placed. Place the bone back into saline or rehydrated with a saline bolus.Ensure all fixture parts are tight and free of movement. In the mechanical tester software, design a bending test profile with a slow displacement ramp rate to avoid viscoelastic effects to load the bone until it fails. After creating a testing profile, create distinct folders for every study group.Select a properly thawed bone, then measure and record its full length using calipers. Load the bone sample onto the fixture in the proper orientation. Alter the file name to reflect the particulars of the sample being tested and save each test in its corresponding folder.Zero the load and activate the system's mover, ensuring it's not in load or displacement control. Carefully apply a slight preload to the bone to secure its position. Avoid compromising the sample.Aim for a preload of about 0.25 Newtons. Make sure the desired bone orientation is kept consistent before moving forward. Hydrate the sample by generously dousing it with saline.On the software, initiate the bending test by selecting start or run. It's crucial to observe the sample for the duration of the test accurately, noting down any occurrences of issues. Monitor closely as the bone starts to fracture.Tests stop automatically when they reach their set limits. But if there's a failure, stop the test manually to avoid damaging the load cell. Once testing is complete, measure the length from the distal end to the breakpoint using calipers and record it.